神經(jīng)遞質(zhì)是生物學(xué)上重要的內(nèi)源性化學(xué)信使，廣泛存在于哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腦組織和體液中，其含量測定對神經(jīng)運動學(xué)、運動生理學(xué)、病理學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、疾病診斷等都有重要意義[1]。腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)一般分為單胺類、肽類、氨基酸等幾類。神經(jīng)遞質(zhì)含量的異常與焦慮癥、抑郁癥、阿爾茲海默病等腦疾病密切相關(guān)。ICE團隊利用液相色譜質(zhì)聯(lián)用法對四種神經(jīng)遞質(zhì)（Glu、GABA、ACh、DA）檢測進行方法學(xué)驗證，并開展了兩種疾病動物模型腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的含量測試[2]。神經(jīng)遞質(zhì)含量的檢測對新藥研發(fā)的治療效果及作用機理研究具有重要的研究意義。
使用超高效液相色譜（UPLC）儀器根據(jù)不同化合物的化學(xué)性質(zhì)進行方法建立，對化合物的線性、準確度、精密度進行數(shù)據(jù)收集，使用Waters Corporation的Empower軟件測量神經(jīng)遞質(zhì)（Glu、GABA、ACh、DA）的峰面積。使用Microsoft Excel 2010版進行數(shù)據(jù)處理，包括算術(shù)平均值（平均值）和標準差、精密度（%RSD）和準確度（%RE）。準確度計算公式：%RE=100×（實測濃度均值?標識濃度）/標識濃度。精密度驗收標準%RSD≤±10%，準確度驗收標準%RE≤±15%。組織測定濃度（μg/mg）=檢測濃度*稀釋倍數(shù)/組織重量，組織測定濃度（μg/g）=檢測濃度*稀釋倍數(shù)*1000/組織重量。使用GraphPad prism8對生物樣本檢測的神經(jīng)遞質(zhì)含量進行統(tǒng)計分析。
1.液相條件
2.標曲制備及結(jié)果
取一定量的Glu、GABA、ACh、DA標準品，用0.2%的甲酸水溶液分別將其溶解成1.00 mg/mL的母液，然后稀釋成0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、6.40 μg/mL的濃度點，進樣分析并擬合線性。其結(jié)果如下：
3.精密度及準確度樣品及結(jié)果
稱取一定量的Glu、GABA、ACh、DA標準品，用0.2%的甲酸水溶液分別將其溶解成1.00 mg/mL的母液，并稀釋成0.40、1.60、4.80?μg/mL的濃度點，進樣并數(shù)據(jù)處理，具體分析結(jié)果如下：
1.1LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥模型脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)是革蘭氏陰性菌的表面抗原物質(zhì)，可作為一種強有效的免疫刺激因子激活小膠質(zhì)細胞，促進炎癥反應(yīng)發(fā)生[3]。本次實驗通過對小鼠腹腔注射LPS (1mg/kg)來制備動物神經(jīng)炎癥模型。6-羥基多巴胺(6-OHDA)是一種類似于去甲腎上腺素的化學(xué)制劑，具有較強的神經(jīng)毒性，在大鼠腦內(nèi)局部注射后能夠高選擇地引起交感神經(jīng)腎上腺素能神經(jīng)末梢的急性潰變，并逆行性造成神經(jīng)元不可逆的損傷[4]。6-羥基多巴胺的作用機制是在腦組織內(nèi)競爭性抑制多巴胺(DA)?[5]，并對線粒體呼吸鏈產(chǎn)生強有力的阻滯作用，導(dǎo)致局部抗氧化物含量及三磷腺苷(ATP)的產(chǎn)生明顯減少[6]，引起多巴胺能神經(jīng)元(nigral dopaminergic neuron，NDN)的特異性凋亡、壞死[7]。1)?將動物置于冰上取材；
2)?稱重后加入組織裂解液；
3)?置于1.5 mL離心管中充分勻漿；
4)?超聲破碎兩次；
5) 14000 rpm，離心15 min；
6)?取上清于另一離心管；7)?重新離心一次，再次取上清液，-80℃保存；
8)?取樣品冰上溶化，離心后使用0.2 μm濾膜過濾；
9)?使用UPLC檢測。2.2.1 LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥模型的神經(jīng)遞質(zhì)檢測
Fig.1?利用UPLC-MS檢測LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥模型組與對照組小鼠的海馬組織中神經(jīng)遞質(zhì)含量，與對照組相比，模型組GABA、ACh、Glu含量明顯降低。2.2.2 6-羥基多巴胺制備帕金森病動物模型的神經(jīng)遞質(zhì)檢測
Fig.2?利用UPLC-MS檢測6-羥基多巴胺制備帕金森病動物模型小鼠的紋狀體中神經(jīng)遞質(zhì)含量，與對照組相比，模型組多巴胺（DA）含量明顯降低。對于神經(jīng)遞質(zhì)檢測，與傳統(tǒng)的HPLC-ECD檢測相比，UPLC-MS或UPLC-MS/MS具有靈敏度高，特異性強，檢測時間短的優(yōu)勢。在四種神經(jīng)遞質(zhì)分析方法驗證中，其中線性、系統(tǒng)適用性、精密度和準確度均滿足生物樣本檢測要求；神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型中的神經(jīng)遞質(zhì)含量檢測結(jié)果顯示:（1）LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥模型中神經(jīng)遞質(zhì)GABA、ACh、Glu含量與對照組相比明顯降低（2）紋狀體組織中神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺（DA）含量顯著降低可作為6-羥基多巴胺腦內(nèi)注射制備帕金森病動物模型成功的一項檢測指標。ICE團隊后續(xù)會制備更多的神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)聯(lián)的動物模型和推出更多的神經(jīng)遞質(zhì)檢測方法，來支持客戶的神經(jīng)系統(tǒng)類疾病相關(guān)的申報與非申報項目。
【參考文獻】
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