上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）在很多癌癥的發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，包括癌細(xì)胞的遷移、侵襲、血管生成和耐藥等。EMT主要通過(guò)上皮細(xì)胞標(biāo)志物cytokeratins和E-cadherin的缺失和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、vimentin和纖連蛋白的上調(diào)等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，這一轉(zhuǎn)化過(guò)程會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞之間的粘附性降低[5]。雜合EMT的主要特征是腫瘤細(xì)胞中上皮基因和間質(zhì)基因的共同表達(dá)，促進(jìn)癌癥的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)[6]。

EMT的發(fā)生發(fā)展與MEK1/2-ERK1/2-Fra1-ZEB1/2信號(hào)通路的激活成正相關(guān)，Wu[7]等人研究了MEK1/2-ERK1/2-Fra1-ZEB1/2的上游調(diào)控因子CRAF與PLK1的互作在EMT過(guò)程發(fā)揮的重要作用。PLK1直接磷酸化S338和S339位點(diǎn)的CRAF，激活CRAF；活化的CRAF經(jīng)過(guò)S621位點(diǎn)的自磷酸化，阻止了蛋白酶介導(dǎo)的CRAF降解，CRAF的穩(wěn)定也在一定程度上增加了PLK1的磷酸化，進(jìn)而產(chǎn)生了一個(gè)正反饋的循環(huán)。該研究將過(guò)表達(dá)PLK1的前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1移植到小鼠體內(nèi)，在NSG小鼠中RWPE-1-PLK1表現(xiàn)出致瘤性和促使腫瘤轉(zhuǎn)移的能力。

圖2.1.2 PLK1在RWPE-1細(xì)胞中的異位表達(dá)的致瘤性和肺部微轉(zhuǎn)移[7]

肺癌已經(jīng)成為全球主要致死癌癥之一，約40%的肺癌患者都會(huì)發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移至腦、肝和腎上腺等部位，嚴(yán)重威脅人的生命[8]。非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC) 患者約占所有肺癌的 85%，生存率極低，臨床相關(guān)性結(jié)果表明，PLK1和TNFAIP6是轉(zhuǎn)移性 NSCLC 患者生存率低的強(qiáng)預(yù)測(cè)因子。研究[9]發(fā)現(xiàn)在T210位點(diǎn)磷酸化的PLK1能促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移、侵襲和致瘤性，而PLK1活性的喪失阻止了腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移活性，S137磷酸化的PLK1則不具有該特性。T210- PLK1 的表達(dá)激活 了TGF-β 信號(hào)通路并上調(diào)TNFAIP6，從而促進(jìn) NSCLC 的轉(zhuǎn)移和侵襲。因此，PLK1 和 TSG6 是轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌治療的有價(jià)值的治療靶點(diǎn)。PLK1促進(jìn)EMT的作用同樣在胃癌細(xì)胞系SGC7901和MKN28中得到驗(yàn)證，并得出PLK1可能通過(guò)AKT信號(hào)通路促進(jìn)胃癌的轉(zhuǎn)移[10,11]。

2.2?細(xì)胞凋亡

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生在相當(dāng)一部分 NSCLC 病例（≥20%）中，可介導(dǎo)癌基因成癮、表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑耐藥和化療耐藥的喪失。PLK1 抑制導(dǎo)致 G2/M 期阻滯，但只有治療敏感的細(xì)胞系在 PLK1 抑制后發(fā)生大量凋亡。具有高上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化基因特征評(píng)分的 NSCLC 細(xì)胞系（間充質(zhì)細(xì)胞系）對(duì) PLK1 抑制的敏感性高于上皮細(xì)胞系；蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果得到相同的結(jié)論[12]。通過(guò)表達(dá) miR-200 誘導(dǎo)上皮表型增加了細(xì)胞對(duì) PLK1 抑制的抗性。該研究將腫瘤分為上皮細(xì)胞系和間充質(zhì)細(xì)胞系兩種亞型，針對(duì)不同亞型對(duì)PLK1抑制劑的敏感性，對(duì)腫瘤進(jìn)行治療，在臨床應(yīng)用上具有重要意義。Caspase-9是參與細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶。Plk1的表達(dá)增加了pro-Caspase9和pro-Caspase3的水平，抑制了細(xì)胞凋亡，表明Plk1具有抑制細(xì)胞凋亡的作用[13]。

焦亡被稱(chēng)為炎癥引起的細(xì)胞程序性死亡，屬于凋亡的一種，在近年來(lái)受到諸多關(guān)注，NLRP3、GSDMD、AIM2、NLRC4、NLRP1等是焦亡研究中最受關(guān)注的位點(diǎn)。最近，研究發(fā)現(xiàn)PLK1抑制劑被證實(shí)是一種有效的治療食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)的方法，BI2536 通過(guò)激活caspase-3，誘導(dǎo)GSDME高表達(dá)細(xì)胞系中GSDME裂解為C-末端片段 (GSDME-CT) 和 N-端片段 (GSDME-NT)，GSDME-NT 也參與膜孔的形成，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡，進(jìn)而增強(qiáng)ESCC細(xì)胞系對(duì)順鉑（DDP）的敏感性[14]。BI2536還可以通過(guò)促進(jìn)caspase-8介導(dǎo)的凋亡通路的激活和PARP的激活來(lái)增加ESCC細(xì)胞系的凋亡，然而，BI2536對(duì)其他已知引起細(xì)胞凋亡的生化標(biāo)記，如caspase-9、cytochromeC和自噬，并無(wú)顯著影響。

2.2.1 BI2536和DDP聯(lián)合用藥活化Caspase-3和增加DSDME胞質(zhì)中的累積進(jìn)而誘導(dǎo)焦亡^[14]

PLK1調(diào)控細(xì)胞周期，調(diào)控細(xì)胞增殖，而敲低PLK1可顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251的增殖、遷移、侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，數(shù)據(jù)顯示，PLK1的下調(diào)顯著提高了U251和U87細(xì)胞中cleaved caspase-3、BIM、BAX和E-cadherin的表達(dá)，降低了MMP9、ATG5和LC3-II的表達(dá)[15]。靶向PLK1可能與自噬的調(diào)控有關(guān)。在對(duì)吉非替尼的抗癌研究中發(fā)現(xiàn)，肝臟特異性Atg7+/-雜合子小鼠的肝損傷比正常對(duì)照小鼠更輕，表明自噬參與了吉非替尼促進(jìn)的肝毒性。而這種自噬促進(jìn)的細(xì)胞凋亡依賴(lài)于PLK1 ，AAV-8介導(dǎo)的PLK1下調(diào)和PLK1抑制劑BI-2536都可以通過(guò)消除COX6A1蛋白的自噬降解來(lái)減輕吉非替尼誘導(dǎo)的肝毒性。此外，PLK1抑制不影響吉非替尼的抗癌活性[16]。PLK1與mTOR的相互作用也與自噬密切相關(guān)[17,18]。含有mSin1.5的mTORC2被認(rèn)為在應(yīng)激信號(hào)傳遞中具有重要功能，PLK1的Rictor磷酸化導(dǎo)致mSin1.5水平的增加，因此在調(diào)控該通路中也可能需要Rictor-S1162的PLK1磷酸化[19] 。研究發(fā)現(xiàn)，抑制PLK1可導(dǎo)致食管鱗癌和AML中mTOR活性的衰減[20,21]。相比之下，Ruf和他的同事描述了PLK1抑制HeLa細(xì)胞中的mTORC1，從而調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)饑餓條件下的自噬[22]。

2.3 DNA損傷

人類(lèi)基因組在各種外源性因素和內(nèi)源性因素破壞造成不同類(lèi)型的DNA損傷，包括DNA單鏈斷裂（SSB）、DNA雙鏈斷裂（DSB）和復(fù)制叉崩潰等。Rad51重組酶以細(xì)胞周期和DNA損傷反應(yīng)的方式被Plk1在S14處直接磷酸化，隨后刺激CK2介導(dǎo)的T13磷酸化， CK2對(duì)Rad51的T13磷酸化觸發(fā)與MRN組分Nbs1的FHA結(jié)構(gòu)域的直接作用，S14或T13處的Rad51磷酸化對(duì)于準(zhǔn)確的HR以及細(xì)胞對(duì)IR和PPAR抑制的抵抗力中發(fā)揮著重要作用[23]。研究發(fā)現(xiàn)DSB修復(fù)因子CtIP是由CDK1/Aurora A和PLK1共同磷酸化的[24]。CDK1/Aurora A介導(dǎo)的CtIP在絲氨酸327處的磷酸化觸發(fā)了CtIP與PLK1 polo-box結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)PLK1在絲氨酸723處磷酸化CtIP。PLK1磷酸化的CtIP突變體不能啟動(dòng)擴(kuò)展末端切除，因此不能介導(dǎo)同源重組和G2/M檢查點(diǎn)，但可以介導(dǎo)MMEJ。這些數(shù)據(jù)暗示PLK1可能以CtIP為靶點(diǎn)，促進(jìn)易出錯(cuò)的MMEJ，并使G2/M檢查點(diǎn)失活[25]。PLK3介導(dǎo)的CtIP磷酸化促進(jìn)了CtIP-BRCA1相互作用，從而啟動(dòng)G1期的末端切除和非同源末端連接（NHEJ）[26]。

2.3 PLK1在DNA損傷修復(fù)中的作用^[23]

3.PLK1抑制劑在癌癥治療中的研究和應(yīng)用

3.1 BI2536

Martin Steegmaier[27]報(bào)道了一種有效的哺乳動(dòng)物PLK1小分子抑制劑BI 2536，BI 2536是第一種能誘導(dǎo)PLK1抑制的所有特征的強(qiáng)效和選擇性PLK1抑制劑，它能在低納摩爾濃度下抑制PLK1酶的活性。該化合、物可在具有不同組織來(lái)源和腫瘤基因組特征的人類(lèi)癌細(xì)胞系中有效地引起有絲分裂停止和誘導(dǎo)凋亡，細(xì)胞在前中期停止，積累磷酸組蛋白H3，并包含異常的有絲分裂紡錘體。同時(shí)，BI 2536在耐受良好的靜脈劑量方案下，抑制裸小鼠人腫瘤異種移植瘤生長(zhǎng)，誘導(dǎo)大腫瘤消退。

圖3.1 BI2536的結(jié)構(gòu)圖

（圖3.1來(lái)自https://www.chemsrc.com/cas/755038-02-9_122800.html）

三陰性乳腺癌 (TNBC)的高發(fā)歸因于腫瘤起始細(xì)胞 (TICs)的存在，通過(guò)全基因組人類(lèi)激酶小干擾 RNA (siRNA) 文庫(kù)篩選，發(fā)現(xiàn)PLK1可能成為治療TNBC 的潛在靶點(diǎn)。siRNA 或 BI 2536 抑制 PLK1 可阻止 TNBC 的生長(zhǎng)，包括 CD44高/CD24 -/低TIC 亞群和乳腺球形成[28]。BI2536在腎上腺皮質(zhì)癌[29]、前列腺癌[30]等也顯示出令人興奮的結(jié)果。在抗纖維化方面，BI2536也表現(xiàn)出其優(yōu)勢(shì)[31]。BI 2536 不會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，但會(huì)嚴(yán)重影響原代成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞在具有單極紡錘體的有絲分裂中被停滯，并在長(zhǎng)時(shí)間停滯后死亡。在 BI 2536 存在下，內(nèi)皮素-1 和去氧腎上腺素刺激對(duì)心肌細(xì)胞和肥大反應(yīng)沒(méi)有觀察到影響。

3.2 BI6727（volasertib）

BI6727，分子式C34H50N8O3，是一種二氫蝶啶酮類(lèi)化合物的 ATP 競(jìng)爭(zhēng)性激酶抑制劑，IC50為0.87 nM，在 BI 2536 二氫蝶啶酮的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上改良的。Volasertib選擇性抑制PLK1，在多種腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)選擇性G2/M阻滯和凋亡，而在正常細(xì)胞中引起G1和G2期可逆的細(xì)胞阻滯而不發(fā)生凋亡。

圖3.2.1 BI6727的結(jié)構(gòu)圖

（圖3.2.1來(lái)自https://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_CN_CB12501403.htm）

早在2009年，就有研究表明，通過(guò)免疫熒光顯微鏡和DNA 含量的熒光細(xì)胞分選分析BI6727對(duì)NCI-H460細(xì)胞增殖的抑制，在24 h，細(xì)胞停滯在G2-M期，結(jié)合細(xì)胞增殖結(jié)果，利用PARP的蛋白表達(dá)結(jié)果確定BI6727在48h誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞的凋亡[32]。上述結(jié)果在膀胱癌研究中也得到證實(shí)[33]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，BI 6727能夠抑制對(duì)高濃度長(zhǎng)春新堿耐藥的NCI-H460細(xì)胞和急性髓性白血病 (AML) 細(xì)胞系的增殖，在異位表達(dá)MDR1基因的黑色素瘤細(xì)胞系(BROmdr)中也得到了類(lèi)似的結(jié)果，顯示出BI 6727對(duì)這些耐藥機(jī)制的低敏感性[34]。BI 6727的藥代動(dòng)力學(xué)特征有利于腫瘤組織在小鼠和大鼠中持續(xù)暴露，具有較高的分布量和較長(zhǎng)的終端半衰期。BI 6727在多種癌癥模型顯示出顯著的抗腫瘤活性，包括紫杉烷耐藥結(jié)直腸癌模型等[34]。迄今為止，BI 6727可以說(shuō)是體外和體內(nèi)最有效的 PLK1 抑制劑之一，已在 I 期和 II 期的試驗(yàn)中顯示出治療潛力，并正在進(jìn)行 III 期試驗(yàn)。該抑制劑也已嘗試與其他抑制劑聯(lián)合使用，并取得了令人鼓舞的成功[35]。FDA授予PLK1抑制劑volasertib突破性治療稱(chēng)號(hào)，當(dāng)其與低劑量阿糖胞苷(LDAC)聯(lián)合使用時(shí)，可用于不適合強(qiáng)化緩解誘導(dǎo)治療的患者對(duì)抗急性髓系白血病(AML) [36]

圖3.2.2 BI6727對(duì)NCI-H460細(xì)胞的抑制和誘導(dǎo)其凋亡[32]

4. PLK1抑制劑聯(lián)合用藥的研究

單一療法目前存在一定的缺陷：1、由于患者之間表觀遺傳差異，對(duì)某些患者有效的藥物可能對(duì)其他患者無(wú)效；2、在腫瘤內(nèi)，只有一小部分腫瘤細(xì)胞可能對(duì)藥物敏感，導(dǎo)致腫瘤不完全破壞；3、單一藥物作用會(huì)提高藥物的耐藥性。而針對(duì)單一療法現(xiàn)有的治療缺陷，聯(lián)合療法提供了以下策略：1、靶向兩種以上的途徑，以便消除具有不同遺傳背景的癌細(xì)胞；2、具有優(yōu)于或者協(xié)同的抗癌作用，從而在細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性之前迅速將其消除[37]。

和其他抗癌藥一樣，BI2536出現(xiàn)了耐藥性，Solanes-Casado S[38]等人在體外建立了耐BI2536的結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT29R、RKOR、SW837R和HCT116R，研究耐藥細(xì)胞的AXL途徑、EMT和MDR1，并在RKOR中發(fā)現(xiàn)PLK1基因突變R136G，與耐藥性密切相關(guān)。Stehle等人證明，在降低橫紋肌肉瘤（RMS）細(xì)胞的細(xì)胞活力和集落形成能力方面，艾日布林（一種新型微管干擾藥物）與PLK1抑制劑BI2536的共同治療明顯比單一療法更有效[39]。另一項(xiàng)研究測(cè)試了BI2536和諾考達(dá)唑的聯(lián)合用藥，諾考達(dá)唑是一種微管毒物，可在DU145晚期前列腺癌（PCa）細(xì)胞中造成M期阻滯。這種組合治療能協(xié)同誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡并抑制PCa細(xì)胞的活力，但不能抑制正常的前列腺上皮細(xì)胞[40]。HBCx-10模型是人類(lèi)三陰性乳腺癌（TNBC）衍生的異種移植模型，在HBCx-10模型中，阿霉素和環(huán)磷酰胺與BI2536的組合可阻止腫瘤復(fù)發(fā)[41]。Lian等人評(píng)估了BI2536與順鉑聯(lián)合治療胃癌，結(jié)果表明，BI2536增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的對(duì)順鉑耐藥胃癌細(xì)胞（SGC-7901/DDP）細(xì)胞活力和侵襲的抑制作用[42]。BI2536顯著提高了DNA烷化劑替莫唑胺（TMZ）在體外以及使用異檸檬酸脫氫酶1（IDH1）突變星形膠質(zhì)細(xì)胞的異種移植小鼠模型中的功效[43]。

結(jié)語(yǔ)

北京愛(ài)思益普生物科技股份有限公司（ICE）專(zhuān)注于從先導(dǎo)化合物篩選，優(yōu)化到臨床前候選分子階段基于細(xì)胞和生化的藥物體外篩選技術(shù)和早期藥物機(jī)理研究，致力于建立全面的靶點(diǎn)篩選和體外生物學(xué)研究平臺(tái)。

在表觀遺傳學(xué)靶點(diǎn)的平臺(tái)拓展和方法研究方面，愛(ài)思益普研發(fā)團(tuán)隊(duì)積級(jí)開(kāi)展了靶向治療中PLK1靶點(diǎn)的研究和分析，已經(jīng)通過(guò)酶學(xué)實(shí)驗(yàn)研究了BI6727對(duì)PLK1激酶活性的作用。

愛(ài)思益普還可通過(guò)In-cell-Western、 HCS、Western Blot、qPCR、LC-MS等技術(shù)精確精準(zhǔn)分析PLK1蛋白靶點(diǎn)、突變位點(diǎn)和聯(lián)合用藥。工作內(nèi)容包括前期細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定、目的化合物篩選等。ICE公司細(xì)胞種類(lèi)貯備充足、設(shè)備前沿、理論知識(shí)充分，在實(shí)驗(yàn)中積累了大量的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，建立體外酶學(xué)、細(xì)胞、DMPK、體內(nèi)一體化平臺(tái)。為后期PLK1靶向藥物的開(kāi)發(fā)及優(yōu)化奠定良好基礎(chǔ)。