2017年8月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)上市了全球第一款CAR-T藥物——Kymriah，適應(yīng)癥為急性淋巴性白血病，由此開啟了人類CAR-T療法的新紀(jì)元。

CAR-T療法，全稱Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，即嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法。簡單來說，CAR-T技術(shù)就如同給T細(xì)胞裝上了GPS導(dǎo)航系統(tǒng)，通過識別并殺傷癌細(xì)胞實現(xiàn)治療的目的。

接續(xù)上期的《FDA指南解讀！CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品開發(fā)在CMC階段的五大注意事項》，本期將繼續(xù)圍繞近期FDA正式發(fā)布的 “Considerations for the Development of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Products”，帶來CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品開發(fā)在非臨床階段的專業(yè)解讀。

（1）使用具有相同抗原識別域的單克隆抗體或融合蛋白進(jìn)行組織交叉反應(yīng)性研究，即分析預(yù)期靶向性的功能問題；

（2）對各種器官/組織的人類原代細(xì)胞、細(xì)胞系、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生測試系統(tǒng)等進(jìn)行細(xì)胞毒性測試，即分析非預(yù)期靶向性的細(xì)胞毒性測試；

（3）蛋白質(zhì)陣列，即通過分析微陣列、功能微陣列和反相微陣列，分析混合物中蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力、特異性和蛋白質(zhì)表達(dá)水平；

（4）相關(guān)動物模型，即分析非預(yù)期靶向性的毒性，或體內(nèi)脫靶效應(yīng)。

（5）對目標(biāo)抗原測定表征，即分析蛋白質(zhì)的各項特性，包括結(jié)構(gòu)、理化、活性等一系列內(nèi)容。

FDA建議申報時包含以前有相同抗原識別域的CAR或單克隆抗體（如適用）的臨床經(jīng)驗中的信息，這可能會減少或消除進(jìn)行額外特異性和親和力測試。確定潛在的脫靶活動對于制定入組標(biāo)準(zhǔn)和特定的輸液后評估和監(jiān)測計劃非常重要。

此外，由于產(chǎn)品之間的固有差異（例如，CAR-T細(xì)胞運輸、擴(kuò)增、產(chǎn)生細(xì)胞因子、誘導(dǎo)細(xì)胞毒性和持久性的能力），利用相同單鏈可變片段（scFv）的CAR-T細(xì)胞和單克隆抗體的安全性可能不同。

多種整合到CAR-T細(xì)胞中的激活和共刺激結(jié)構(gòu)域，包括CD3ζ鏈、4-1BB（CD137）、CD28和CD40等，這些域組合可導(dǎo)致不同的生物學(xué)特性。這可能會影響體內(nèi)細(xì)胞擴(kuò)增、持久性和其他免疫細(xì)胞類型激活的程度。解決CAR-T細(xì)胞非依賴細(xì)胞因子生長和不受控制增殖的可能性是臨床前評估的另一個重要方面。

（2）含有其他污染細(xì)胞（如NK細(xì)胞、B細(xì)胞等）的未選擇T細(xì)胞池；

（3）病毒抗原特異性T細(xì)胞（例如巨細(xì)胞病毒（CMV）、EB病毒（EBV））；

（4）選擇干細(xì)胞樣或“年輕”T細(xì)胞。

因此，臨床前評估可能包括檢測細(xì)胞因子非依賴性細(xì)胞生長、體外和體內(nèi)T細(xì)胞克隆性測試、核型分析、TCR譜分析，以及通過體外刺激和識別檢測對病毒抗原的特異性。

圖1：患者來源的異種移植小鼠用于CAR T細(xì)胞評估，文獻(xiàn)：Humanized Mice Are Precious Tools for Preclinical Evaluation of CAR T and CAR NK Cell Therapies[J]. Cancers, 2020, 12(7)

CAR-T細(xì)胞安全和活性的參數(shù)是多因素的，包括：

（1）載體結(jié)構(gòu)的設(shè)計（例如，抗原識別結(jié)構(gòu)域、信號結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和鉸鏈結(jié)構(gòu)域），引入的外源基因種類、數(shù)量、長度越少越好；

（2）載體傳遞方法，病毒類載體元件涉及的越少越好；

（3）細(xì)胞來源，背景越明確越好；

（4）操作過程（例如激活、細(xì)胞選擇），人員操作越少越好；

（5）生物活性（例如，細(xì)胞因子表達(dá)譜、細(xì)胞毒性、增殖），數(shù)據(jù)越全越好；

（6）添加新成分（如自殺基因、免疫調(diào)節(jié)元件），背景和數(shù)據(jù)越全越好。

NMPA于2021年11月頒布的《基因修飾細(xì)胞治療產(chǎn)品非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》對基因修飾細(xì)胞治療產(chǎn)品非臨床有效性和概念驗證、藥代動力學(xué)、轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物和插入突變風(fēng)險評估做了論述，強(qiáng)調(diào)了免疫細(xì)胞應(yīng)盡可能采用多種方法評估其靶點相關(guān)毒性和脫靶毒性風(fēng)險。