阿爾茨海默病（AD）是老年期最常見的慢性疾病，以進(jìn)行性記憶下降和認(rèn)知功能減退為特征。AD不但嚴(yán)重影響了病人的生活質(zhì)量，也給患者家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。

AD的組織病理學(xué)變化主要是老年斑（SP）、神經(jīng)元纖維纏結(jié)（NET），基于此，科學(xué)家已經(jīng)提出了β淀粉樣蛋白假說[1]和Tau蛋白異常磷酸化假說[2]來解釋發(fā)病機(jī)制。盡管在發(fā)病機(jī)制的研究方面取得了進(jìn)展，但迄今為止，疾病治療的研究幾乎都沒有取得成功。主要原因之一是缺乏能夠全面模擬疾病的動(dòng)物模型。

實(shí)際上，在過去的20年里，科學(xué)家已經(jīng)開發(fā)了200多種AD動(dòng)物模型。大多數(shù)AD模型是過度表達(dá)人類App（淀粉樣前體蛋白）基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。這些模型雖然可以觀察到Aβ蛋白的沉積，卻沒有出現(xiàn)其他AD病理特征，比如tau病理和神經(jīng)元死亡。因此，如何開發(fā)能夠全面模擬AD發(fā)病機(jī)制的模型，是研究人員急需解決的問題。

近日，來自清華大學(xué)藥學(xué)院的魯白和郭煒教授領(lǐng)銜團(tuán)隊(duì)在著名期刊Cell Research發(fā)表重要研究結(jié)果[3]。

在這項(xiàng)研究中，他們使用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，用人源化且攜帶三個(gè)人類家族突變的App基因成功替換了大鼠同類基因，這就保證了App基因在大鼠體內(nèi)的正常表達(dá)，而避免之前模型的過表達(dá)情況。讓人驚喜的是，這個(gè)AD大鼠模型表現(xiàn)出類似于AD患者的病理和疾病進(jìn)展，這在AD模型中尚屬首次。

論文首頁(yè)截圖

考慮到與小鼠相比，大鼠的生理行為特征更接近人類，魯白和郭煒團(tuán)隊(duì)將大鼠作為改造對(duì)象。

他們先在NCBI中檢索了大鼠和人類App基因的DNA序列，并分析了由App基因第16、17外顯子編碼的Aβ42肽序列。為了構(gòu)建App基因敲入大鼠，他們將大鼠App基因的Aβ42的序列及其周圍突變位點(diǎn)序列替換為人類序列。具體來講，就是將Swedish突變（K670N和M671L）引入16號(hào)外顯子，將Beyreuther/Iberian（I716F）和Arctic（E693G）突變引入到第17號(hào)外顯子。

此外，為了實(shí)現(xiàn)Aβ序列的人源化，還引入了G676R、F681Y和R684H三個(gè)氨基酸的替換突變。

最后，他們使用CRISPR/Cas9基因敲入技術(shù)，獲得純合App敲入大鼠，命名為純合App^NL-G-F。至此，他們成功將三個(gè)分布在App基因的兩個(gè)外顯子上的家系突變，同時(shí)準(zhǔn)確無誤地敲入大鼠基因組，并實(shí)現(xiàn)人源化，這是一項(xiàng)非常具有挑戰(zhàn)性的工作[4]。

使用CRISPR/Cas9技術(shù)產(chǎn)生帶有三個(gè)家族突變的App敲入大鼠

為了了解這個(gè)模型與以往轉(zhuǎn)基因模型相比的優(yōu)勢(shì)，魯白和郭煒團(tuán)隊(duì)從病理層面和行為層面對(duì)該AD模型進(jìn)行了評(píng)估。

首先，App^NL-G-F大鼠確實(shí)避免了轉(zhuǎn)基因技術(shù)中App過度表達(dá)的問題。App轉(zhuǎn)基因小鼠最大的缺陷是App蛋白表達(dá)水平比正常水平高得多，這會(huì)擾亂小鼠的正常生理功能。因此，很難判斷在動(dòng)物中觀察到的突觸和行為缺陷，是由于Aβ蛋白的沉積，還是由于非生理性表達(dá)的App及其代謝物。而嵌合App基因的表達(dá)由大鼠內(nèi)源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，保留了App及其代謝物的內(nèi)源水平。

其次，模型顯示了全面的Aβ病理學(xué)特征。App^NL-G-F大鼠小腦中存在著豐富的Aβ寡聚體和斑塊，它們?cè)谛∧X中的空間分布也與人類AD大腦中的淀粉樣病變相似。

魯白和郭煒團(tuán)隊(duì)還觀察到類似于人類的Tau蛋白異常磷酸化形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)（NET）。tau蛋白病理性聚集而形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)是AD的另一個(gè)標(biāo)志，而迄今為止報(bào)告的App突變小鼠模型都沒有表現(xiàn)出tau病理學(xué)。這顯示了App^NL-G-F大鼠模型的另一優(yōu)越性。

此外，這個(gè)大鼠模型還表現(xiàn)出由細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡介導(dǎo)的神經(jīng)元死亡，以及大腦皮層的嚴(yán)重萎縮，從MRI圖像上可以觀察到腦室擴(kuò)大。而無論是轉(zhuǎn)基因的“一代小鼠模型”[5]，還是基因敲入的“二代小鼠模型”[6]，都沒有出現(xiàn)神經(jīng)元的死亡或腦萎縮。

冠狀面上，與 WT 相比，純合App^NL-G-F大鼠的側(cè)腦室擴(kuò)大

在行為層面上，魯白和郭煒團(tuán)隊(duì)測(cè)試了App^NL-G-F大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能和情景記憶功能。無運(yùn)動(dòng)功能障礙的AD大鼠在Morris水迷宮 （MWM） 測(cè)試中顯示出空間認(rèn)知缺陷，無視覺功能障礙的AD大鼠在觸摸屏操作測(cè)試中顯示情景認(rèn)知缺陷。這些實(shí)驗(yàn)表明App^NL-G-F大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶以及情景記憶均受損。

除此之外，魯白和郭煒團(tuán)隊(duì)在評(píng)估模型的過程中還發(fā)現(xiàn)：App^NL-G-F大鼠的病理變化（Aβ沉積、神經(jīng)膠質(zhì)增生、tau病理、突觸變性、認(rèn)知缺陷）發(fā)生的時(shí)間順序，都與AD患者相似；而且，tau病理總是出現(xiàn)在Aβ沉積之后，這似乎提示著Aβ沉積與tau病理之間存在著因果關(guān)系。這些發(fā)現(xiàn)為繼續(xù)深入研究AD發(fā)病機(jī)制提供了方向。

更有趣的是，雌性App^NL-G-F大鼠表現(xiàn)出比雄性更具侵襲性的Aβ病理進(jìn)展，這與在人類中觀察到的非常相似：大約三分之二的AD患者是女性。這提示著App^NL-G-F模型在揭示AD發(fā)病性別差異的潛在機(jī)制中可能發(fā)揮作用。

總之，App^NL-G-F大鼠模型表現(xiàn)出更類似于AD患者的Aβ斑塊沉積、小膠質(zhì)細(xì)胞激活和神經(jīng)膠質(zhì)增生、進(jìn)行性突觸變性和 AD 相關(guān)的認(rèn)知缺陷，同時(shí)研究者還觀察到了 tau 病理學(xué)、神經(jīng)元凋亡和壞死性凋亡以及腦萎縮。

與之前的模型相比之后，不難看出，App^NL-G-F大鼠模型為AD研究、識(shí)別新的藥物靶點(diǎn)以及測(cè)試治療方法提供了不可或缺的工具。

期待中國(guó)科學(xué)家的這一重大基礎(chǔ)研究進(jìn)展，能給AD的治療帶來新的突破。

參考文獻(xiàn)：

【1】Selkoe DJ, Hardy J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Mol Med. 2016 Jun 1;8(6):595-608. doi: 10.15252/emmm.201606210. PMID: 27025652; PMCID: PMC4888851.

【2】van der Kant R, Goldstein LSB, Ossenkoppele R. Amyloid-β-independent regulators of tau pathology in Alzheimer disease. Nat Rev Neurosci. 2020 Jan;21(1):21-35. doi: 10.1038/s41583-019-0240-3. Epub 2019 Nov 28. PMID: 31780819.

【3】Pang K, Jiang R, Zhang W, Yang Z, Li LL, Shimozawa M, Tambaro S, Mayer J, Zhang B, Li M, Wang J, Liu H, Yang A, Chen X, Liu J, Winblad B, Han H, Jiang T, Wang W, Nilsson P, Guo W, Lu B. An App knock-in rat model for Alzheimer's disease exhibiting Aβ and tau pathologies, neuronal death and cognitive impairments. Cell Res. 2021 Nov 17. doi: 10.1038/s41422-021-00582-x. Epub ahead of print. PMID: 34789895.

【4】https://www.tsinghua.edu.cn/info/1175/89139.htm

【5】Sasaguri H, Nilsson P, Hashimoto S, Nagata K, Saito T, De Strooper B, Hardy J, Vassar R, Winblad B, Saido TC. APP mouse models for Alzheimer's disease preclinical studies. EMBO J. 2017 Sep 1;36(17):2473-2487. doi: 10.15252/embj.201797397. Epub 2017 Aug 1. PMID: 28768718; PMCID: PMC5579350.

【6】Kawasumi M, Chiba T, Yamada M, Miyamae-Kaneko M, Matsuoka M, Nakahara J, Tomita T, Iwatsubo T, Kato S, Aiso S, Nishimoto I, Kouyama K. Targeted introduction of V642I mutation in amyloid precursor protein gene causes functional abnormality resembling early stage of Alzheimer's disease in aged mice. Eur J Neurosci. 2004 May;19(10):2826-38. doi: 10.1111/j.0953-816X.2004.03397.x. PMID: 15147316.

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