隨著新冠疫情的發(fā)展，在新冠疫苗的研發(fā)中，疫苗接種機(jī)體后能否有效避免無癥狀感染和抑制病毒的再傳播逐漸受到重視，其中的一個(gè)關(guān)鍵就是能否有效激活CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞免疫應(yīng)答，清除被病毒感染的細(xì)胞。尤其是在病毒不斷變異的情況下，細(xì)胞免疫的識別序列保守性以及長期的記憶性特點(diǎn)有希望實(shí)現(xiàn)廣譜的抗感染效果。因此，新冠刺突蛋白(S)的保守CD8+T表位一直是科學(xué)家和疫苗研發(fā)人員的尋找目標(biāo)。

近日，一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)為評估疫苗免疫后由CD8+ T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)提供了工具，也為研發(fā)出更加有效和廣譜的新冠疫苗提供了新的靶點(diǎn)和思路。經(jīng)過進(jìn)一步的深入分析發(fā)現(xiàn)，該表位肽序列不僅在已知野生型、VOC和VOI的突變株中高度保守，在目前新出現(xiàn)的Omicron變異株中仍然高度保守。

在線期刊《BioRxiv》發(fā)表的名為Identification ofa promiscuous conserved CTL epitope within the SARS-CoV-2 spike protein的文章，詳細(xì)展示了相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)：

• 覆蓋新冠病毒Spike蛋白中NTD和RBD區(qū)域的重疊氨基酸多肽庫（Pool 1）具有較強(qiáng)的CTL表位活性；

• 在重疊氨基酸多肽庫（Pool 1）中，發(fā)現(xiàn)一段具有較強(qiáng)CTL表位功能的多肽（Peptide 2），這段多肽在目前SARS-CoV-2各種流行變異株中高度保守，與世界上大多數(shù)人群的HLA等位基因相兼容。

多肽庫Pool 1中存在具有較強(qiáng)CD8+ CTL表位活性的多肽

研究利用BALB/c小鼠動(dòng)物模型，經(jīng)過可在體內(nèi)表達(dá)SARS-CoV-2刺突蛋白的pGX9501新冠DNA疫苗兩劑次免疫，通過ELIspot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：相較于對照組S2蛋白的重疊氨基酸多肽庫（Pool2），使用Pool 1刺激淋巴細(xì)胞后新冠抗原特異性IFN-γ的表達(dá)量顯著升高（圖1）。同時(shí)，體內(nèi)CTL實(shí)驗(yàn)顯示，Pool 1在體內(nèi)能夠激發(fā)強(qiáng)烈的CTL細(xì)胞反應(yīng)（圖2）。這些結(jié)果表明，在多肽庫Pool 1中存在著MHC I表位。

圖1：ELISpot檢測多肽庫體外刺激pGX501免疫后BALB/c小鼠淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的水平

圖2：體內(nèi)CTL殺傷實(shí)驗(yàn)，相對于對照空載體pVAX1和野生型pVAX1-S-WT DNA疫苗免疫組，Pool 1檢測出pGX9501免疫的小鼠顯著的抗原特異性CTL反應(yīng)

鑒定出多肽庫Pool 1中存在的一段具有較強(qiáng)MHC-I表位功能的多肽Peptide2

通過IEBD表位在線分析，研究團(tuán)隊(duì)對肽庫Pool 1中的氨基酸序列進(jìn)行分析。同時(shí)，為提高預(yù)測的準(zhǔn)確性，分析過程還采用了H-2d MHC-I等位基因的MHC I親和力預(yù)測、MHC-I免疫原性預(yù)測以及MHC分子天然加工（MHC-NP）預(yù)測這三種方法。根據(jù)不同等位基因條件下各種預(yù)測方案下的得分，找出了Peptide2、11、12這三個(gè)多肽可能具有較強(qiáng)的MHC-I表位功能（如圖3及原文數(shù)據(jù)）。

圖3：IEBD表位在線分析預(yù)測結(jié)果，A為免疫原性評分，B為TAP結(jié)合功能評分

通過ELIspot實(shí)驗(yàn)，對IEBD預(yù)測評分高的多肽是否具有強(qiáng)MHC表位功能進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明Peptide2相較于其他兩種多肽，能夠刺激出更高的IFN-γ產(chǎn)生（圖4A）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Peptide 2激活的是CD8+ T細(xì)胞而非CD4+ T細(xì)胞（圖4B）。根據(jù)H-2d MHC-I等位基因的偏好性預(yù)測Peptide2中的錨定氨基酸位點(diǎn)，然后將這些位點(diǎn)進(jìn)行突變，驗(yàn)證結(jié)果表明不僅IEDB分析的親和力分值顯著下降（表1），且刺激CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ的水平也顯著降低（圖5）。

圖4：ELISpot實(shí)驗(yàn)評價(jià)候選多肽的功能。圖A比較了Pool1中不同的多肽片段體外刺激IFN-γ分泌的情況；圖B驗(yàn)證了多肽分別刺激CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ的水平

表1：IEBD比較Peptide2及氨基酸序列突變后的Peptide2與MHC-I分子的親和性

圖5：ELISpot實(shí)驗(yàn)比較Peptide2及氨基酸序列突變后的Peptide2體外刺激淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的水平

Peptide 2序列高度保守，且與世界上大多數(shù)人群HLA等位基因相兼容

研究比對了Peptide 2氨基酸序列與WHO公布的SARS-CoV-2多種突變株，包括關(guān)切變異株（VOC）和關(guān)注變異株（VOI）在內(nèi)的多種突變毒株序列，均發(fā)現(xiàn)Peptide 2序列高度保守（如圖6A），位于刺突蛋白NTD區(qū)域末端及RBD上游（圖6B）。這種高度保守的表位序列為評估疫苗免疫后CD8+介導(dǎo)的免疫反應(yīng)提供了重要的工具。

圖6：A圖顯示Peptide 2 (黃色)與突變株序列比對；B圖顯示Peptide 2（黃色）在刺突蛋白結(jié)構(gòu)中的位置

由于MHC-I基因在全球范圍不同人群中存在遺傳學(xué)上的差異和多樣性特點(diǎn)，同一抗原多肽表位序列可能被某地區(qū)的人群MHC-1分子識別，但無法被其他群體識別或者識別能力很低，從而限制了其表位的廣譜性的應(yīng)用。為分析Peptide 2是否可以被世界范圍內(nèi)大多數(shù)群體識別，該研究對不同區(qū)域人群中27個(gè)主流的MHC-1型分子等位基因（Human Leukocyte Antigen, HLA）進(jìn)行分析（圖表見原文）。經(jīng)過對Peptide 2與這些分子相互作用的評估，針對其與HLA親和力、免疫原性以及TAP潛力的預(yù)測評分，結(jié)果顯示Peptide 2表位可以被 HLA-A*02:01 （歐美地區(qū)）， HLA-B*08:01（歐洲及澳大利亞地區(qū)），HLA-A*23:01（北非和撒哈拉以南的非洲，HLA-A*02:03（東南亞地區(qū)），HLA-A*24:02（大洋洲），HLA-A*02:06 （北非、東南亞及大洋洲），HLA-A*33:01 （中國和巴基斯坦），HLA- B*35:01（大洋洲）以及HLA-A*03:01 （歐洲）識別，顯示出了Peptide 2的廣譜兼容性。

可以看出，在SARS-CoV-2病毒刺突蛋白中涵蓋NTD和RBD區(qū)域的重疊多肽庫中發(fā)現(xiàn)的這種具有與MHC-I高親和且序列保守，同時(shí)兼容世界上大多數(shù)人群HLA等位基因的表位序列（Peptide 2），該表位有望成為評估疫苗免疫后CD8+ T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的重要工具，以及有望成為開發(fā)更有效廣譜的新冠疫苗候選產(chǎn)品的潛在靶標(biāo)。

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