作者：申城胡哥

目前上市的5款 BTK抑制劑^[1]均為共價(jià)抑制劑（圖1），通過(guò)共價(jià)結(jié)合的方式與BTK蛋白激酶域中的C481不可逆結(jié)合，達(dá)到抑制BTK酶活性的目的。現(xiàn)有的BTK抑制劑（例如依魯替尼和阿卡替尼）在治療BTK依賴性B細(xì)胞惡性腫瘤方面有較好的療效。但是，長(zhǎng)期使用這些共價(jià)型BTK抑制劑后BTK 會(huì)產(chǎn)生C481突變（半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基取代），并對(duì)這些藥物產(chǎn)生獲得性耐藥，進(jìn)而出現(xiàn)療效減弱。而非共價(jià)BTK抑制劑，不與C481產(chǎn)生共價(jià)結(jié)合，因此C481突變不會(huì)導(dǎo)致抑制劑的活性降低，可克服人體對(duì)共價(jià)BTK抑制劑的耐藥性，此外PROTACS、藥物聯(lián)用或多靶點(diǎn)治療也為解決耐藥提供了新的思路^[2]。

圖1 批準(zhǔn)上市的BTK抑制劑

LOXO-305和禮來(lái)

12月12日，禮來(lái)和默沙東在第63屆美國(guó)血液學(xué)會(huì)(ASH)年會(huì)上公布了各自口服、高選擇性、非共價(jià)可逆BTK C481S抑制劑pirtobrutinib（LOXO-305）和MK-1026在惡性血液腫瘤中的療效數(shù)據(jù)^[3]。驚艷的數(shù)據(jù)凸顯BTK非共價(jià)可逆抑制劑的巨大潛力（圖2）^[4]。非共價(jià)抑制劑是激酶抑制劑設(shè)計(jì)的常見(jiàn)方法，競(jìng)爭(zhēng)性占據(jù)ATP與激酶結(jié)合口袋，但與激酶結(jié)合后經(jīng)代謝可脫離，不會(huì)對(duì)靶蛋白造成不可逆的損害，不易形成耐藥。下文將簡(jiǎn)單介紹目前進(jìn)展最快的LOXO305和臨床在研的BTK可逆抑制劑。

LOXO-305最初由英國(guó)一家名為Redx Pharma的公司開(kāi)發(fā)，原名 RXC005，后來(lái)該項(xiàng)目被美國(guó) LoxoOncology公司收購(gòu)，更名為L(zhǎng)OXO-305，并于2018年被推入臨床階段。2019 年禮來(lái)公司以約80億美元收購(gòu)了Loxo Oncology，囊括一系列抗癌靶向藥，其中就包括LOXO305^[5]。

圖2 Pirtobrutinib部分臨床數(shù)據(jù)

圖3 推測(cè)的LOXO305發(fā)現(xiàn)過(guò)程

專利WO2017103611披露了包含LOXO305的結(jié)構(gòu)通式，根據(jù)伊布替尼的藥效團(tuán)模型（圖3），包含三個(gè)部分，hinge region、H3口袋（疏水口袋）、共價(jià)結(jié)合區(qū)（與481位的半胱氨酸共價(jià)結(jié)合）；把伊布替尼的吡唑并嘧啶胺開(kāi)環(huán)得到吡唑鄰位帶氨基的酰胺，氨基和酰胺通過(guò)氫鍵形成一個(gè)偽雙環(huán)，把H3口袋中氧連接的疏水基團(tuán)改為酰胺亞甲基連接的芳香環(huán)，共價(jià)結(jié)合區(qū)則改成非共價(jià)結(jié)合的CF3取代的乙基，最終優(yōu)化得到LOXO305。

表1 LOXO-305高效、選擇性地抑制BTK和BTK C481S激酶活性

在激酶抑制活性測(cè)試中（表1），LOXO-305對(duì)371種野生型激酶測(cè)試，其對(duì) BTK和C481突變BTK的抑制活性（IC50值）分別為1.42和3.15 nmol/L（高于其他激酶約300倍）。在體外細(xì)胞模型（圖4）中，依魯替尼和LOXO-305對(duì)HEK293細(xì)胞中BTK的抑制活性（IC50值）分別為5.7和8.6 nmol/L。而在C481突變的HEK293細(xì)胞中，依魯替尼對(duì)HEK293的抑制活性下降到1 μmol/L以上，LOXO-305對(duì)BTK的抑制活性仍達(dá)到8.8 nmol/L。這說(shuō)明LOXO-305對(duì)BTK的抑制能力基本不受C481突變的影響^[6]。

圖4 BTK體外細(xì)胞模型

表2 體外實(shí)驗(yàn)中LOXO-305具有低的人肝微粒體清除和高滲透性

表3 動(dòng)物研究中LOXO-305的藥代動(dòng)力學(xué)

在禁食/未禁食交叉研究中^[7]，對(duì)8只比格犬在第1 天和第8天給予30 mpk的LOXO-305，給藥后48 h采集血樣。結(jié)果顯示：禁食組最大血藥濃度（Cmax）為18100 ng/mL，血藥濃度-時(shí)間曲線下面積（AUC0~t）為162000 ng·h/ml；未禁食組Cmax為10000 ng/mL，AUC0~t為105000 ng·h·mL-1。另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)4只未禁食的Sprague Dawley大鼠單次給予35mpk 的LOXO-305，給藥后24 h內(nèi)采集血樣。結(jié)果顯示：Cmax為7930 ng/mL，AUC0~t為82200 ng·h·mL-1。表明口服給藥后大鼠和犬的血漿暴露水平較高，預(yù)計(jì)BTK和BTK C481S靶區(qū)覆蓋水平較高?；谌梭w細(xì)胞模型的體外藥物代謝動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3，根據(jù)體外試驗(yàn)數(shù)據(jù)判斷LOXO-305具有較低的人體清除率和較高的滲透性（表3）。此外，臨床試驗(yàn) NCT03740529公布的部分人體藥物代謝動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)顯示，患者血液中LOXO-305的暴露量隨給藥劑量增加呈線性增加。^[8]

可逆抑制劑有望解決耐藥問(wèn)題

針對(duì)C481突變的臨床在研BTK可逆抑制劑包括共價(jià)和非共價(jià)兩種形式，如下表所示。

表4 代表性BTK可逆抑制劑^[5]

PRN1008和SAR-444727屬于可逆共價(jià)抑制劑，結(jié)構(gòu)中的氰基是一大特征^[11]。這類化合物（圖5A）嵌入可逆的氰基丙烯酰胺基親電試劑，通過(guò)哌啶或吡咯烷連接到吡唑嘧啶骨架上。氰基丙烯酰胺官能團(tuán)則連接著具有不同空間位阻和電子性質(zhì)的烷基或雜烷基，這可以影響可逆抑制劑的residence time^[10]。圖5B中的配合物(PDB代碼4YHF)的晶體結(jié)構(gòu)中，配體與Cys481共價(jià)結(jié)合，氨基吡咯嘧啶部分與Thr474、Glu475和Met477形成氫鍵。叔丁基屏蔽了Cα上的質(zhì)子，防止了與Cys481的硫醚鍵斷裂。而氰基的引入使得Cα氫的酸性增強(qiáng)，半胱氨酸的不可逆加成變?yōu)榭赡婕映?。可逆共價(jià)抑制劑的親電彈頭多為氰基、酮羰基等可逆親核加成反應(yīng)受體，其與靶標(biāo)共價(jià)結(jié)合的可逆性，使得可逆共價(jià)抑制劑的藥代動(dòng)力學(xué)特征介于不可逆共價(jià)抑制劑和非共價(jià)抑制劑之間。可逆共價(jià)抑制劑具有抑制作用時(shí)間長(zhǎng)、有效濃度低、降低脫靶毒性的優(yōu)點(diǎn)。

圖5 (A) PRN1008、1和2的化學(xué)結(jié)構(gòu)。(B) 氰基化合物1的晶體配合物的Ligplot

CGI-1746是吉利德研發(fā)的可逆非共價(jià)BTK抑制劑，結(jié)構(gòu)中的叔丁基苯基占據(jù)H3口袋，其吡嗪酮母核與Met477形成2個(gè)氫鍵，且吡嗪酮母核酰胺結(jié)構(gòu)的NH與Lys430形成氫鍵，不與Cys481結(jié)合，活性較高。但結(jié)構(gòu)中的叔丁基與酰胺在體內(nèi)易發(fā)生羥基化、水解而代謝失活，影響成藥性。羅氏以吡啶酮為母核降低親脂性，引入苯甲醇與F取代的雙環(huán)內(nèi)酰胺得到RN-486，活性增強(qiáng)6倍。Genentech以六氫苯并噻吩代替叔丁基苯基得到GDC-0834，但其分子仍存在不穩(wěn)定的酰胺鍵，通過(guò)酰胺與吡咯關(guān)成雙環(huán)占據(jù)H3口袋得到GDC-0853，活性提高至0.91 nmol/L。GDC-0853對(duì)BTK各突變型細(xì)胞株的活性與野生型相當(dāng)，目前處于臨床三期，體內(nèi)易代謝和動(dòng)力學(xué)較差仍是其隱患。

BMS的BMS-935177是一類咔唑類分子，IC50為3 nmol/L，毒性研究表明該化合物在多種動(dòng)物中治療窗較窄。后續(xù)BMS-986142的IC50提高至0.5 nmol/L，具有良好的體內(nèi)安全性，但類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征的適應(yīng)癥，目前在臨床二期無(wú)進(jìn)展。日本的Carna Biosciences公司把RN-486的吡啶酮經(jīng)骨架躍遷改成嘧啶胺，后關(guān)成吲哚環(huán)并在溶劑可及區(qū)優(yōu)化片段得到AS1763，目前處于臨床一期，適應(yīng)癥為慢性淋巴細(xì)胞白血病。

圖6 GDC0853和RN486的改造思路

ARQ-531（MK-1026）是默克研發(fā)的一種有效的ATP 競(jìng)爭(zhēng)性的，可逆非共價(jià)BTK抑制劑，其IC50值為0.39 nmol·L-1，其核心吡咯并嘧啶環(huán)與Gly475和Tyr476殘基的鉸鏈主鏈形成雙齒配位的氫鍵；與依魯替尼類似，苯氧基苯基占據(jù) ATP的疏水口袋，氯原子則位于Ala428和Lys430 側(cè)鏈之間；四氫吡喃甲醇的側(cè)鏈則暴露在溶液環(huán)境，有利于水分子介導(dǎo)的廣泛氫鍵網(wǎng)絡(luò)。正是由于這個(gè)空間因素的限制，ARQ-531無(wú)法接近Cys481形成共價(jià)鍵^[12]。

技術(shù)迭代也是創(chuàng)新的一種思路

目前已上市的BTK抑制劑全球銷(xiāo)售規(guī)模超過(guò)100億美元。其中伊布替尼2020年全球銷(xiāo)售規(guī)模達(dá)到94.4億美元（2021年前三季度已銷(xiāo)售73.7億美元），屬于史詩(shī)級(jí)重磅炸彈產(chǎn)品。第一代不可逆 BTK抑制劑依魯替尼目前的適應(yīng)證包括 MCL、WM、CLL、移植物宿主病等^[9]。第二代不可逆BTK抑制劑阿卡替尼和澤布替尼目前臨床獲批的適應(yīng)證僅有MCL，但它相較于依魯替尼對(duì)BTK選擇性更高，因此毒性有所降低，但是因Cys481位點(diǎn)突變引起的耐藥性問(wèn)題仍然沒(méi)有解決。BTK可逆抑制劑的發(fā)現(xiàn)有望解決這一問(wèn)題，它們不依賴481位半胱氨酸結(jié)合位點(diǎn)。而LOXO305和ARQ531作為代表性的BTK非共價(jià)可逆抑制劑，目前臨床進(jìn)展最為靠前。

靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重依賴基礎(chǔ)科研，但不代表產(chǎn)業(yè)界就沒(méi)有發(fā)揮空間，企業(yè)仍可以在成熟領(lǐng)域持續(xù)做技術(shù)方面的改進(jìn)。腫瘤因其內(nèi)源性和復(fù)雜性，腫瘤藥一直是創(chuàng)新藥的珠峰，沒(méi)有百分之百滿足的臨床需求，就是未滿足的臨床需求。在新藥開(kāi)發(fā)的思路上，與其卷起來(lái)，不如鉆進(jìn)去。

參考文獻(xiàn)：

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3.醫(yī)藥魔方Info公眾號(hào)；療效驚艷！禮來(lái)、默沙東公布BTKC481S抑制劑最新數(shù)據(jù).

4.Wojciech Jurczak etal;Pirtobrutinib, A Highly Selective, Non-covalent (Reversible) BTK Inhibitor In Previously Treated CLL/ SLL: Updated Results From The Phase1/2 BRUIN Study; 2021 ASH ANNUAL MEETING & EXPOSITION;

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11.Andrea Spallarossa et al; Btk Inhibitors: A Medicinal Chemistry and Drug Delivery Perspective; Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 7641.

12.H. Yesid Estupin?án et al;BTK gatekeeper residue variation combined with cysteine 481 substitution causes super-resistance to irreversible inhibitors acalabrutinib, ibrutinib and zanubrutinib; Leukemia (2021) 35:1317–1329.

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