文丨依然

迄今為止，CAR-T（嵌合抗原受體T）細(xì)胞療法的運(yùn)用主要集中在癌癥領(lǐng)域。這種療法可以幫助T細(xì)胞正確識(shí)別并摧毀癌細(xì)胞。為此，首先需要從患者的血液中提取T細(xì)胞，并進(jìn)行特定的基因修飾編程，增強(qiáng)其攻擊和殺死癌細(xì)胞的能力。然后將修飾后的T細(xì)胞大量培養(yǎng)，并重新注入患者體內(nèi)?？梢哉f，CAR-T細(xì)胞療法自被提出以來，就一躍成為了治療癌癥的明星療法。網(wǎng)傳“120萬抗癌神藥”其實(shí)就是一種“CAR-T細(xì)胞”靜脈注射液。

然而，當(dāng)針對(duì)人類心力衰竭或其他纖維化疾病時(shí)，這種標(biāo)準(zhǔn)的CAR-T細(xì)胞技術(shù)會(huì)出現(xiàn)問題。成纖維細(xì)胞在體內(nèi)具有正常而重要的功能，尤其是在傷口愈合方面。經(jīng)過基因重編程以攻擊成纖維細(xì)胞的CAR-T細(xì)胞可以在體內(nèi)存活數(shù)月甚至數(shù)年，從而抑制成纖維細(xì)胞數(shù)量，并且會(huì)持續(xù)影響傷口愈合。

近日，來自賓夕法尼亞大學(xué)佩雷爾曼醫(yī)學(xué)院的研究人員開創(chuàng)了一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)性免疫療法，解決了上述常規(guī)療法存在的特異性問題，即僅通過一次注射信使RNA（mRNA）就可以瞬時(shí)重新編程患者體內(nèi)的免疫細(xì)胞（該技術(shù)基于CAR-T細(xì)胞療法），使其對(duì)特定目標(biāo)予以攻擊，這類似于mRNA類型的COVID-19疫苗。

該研究發(fā)表在國際知名期刊Science上，研究人員通過以T細(xì)胞靶向脂質(zhì)納米顆粒（LNP）為載體遞送修飾的mRNA，使其在體內(nèi)產(chǎn)生瞬時(shí)CAR-T細(xì)胞來攻擊心臟成纖維細(xì)胞。心力衰竭通常在一定程度上是由這些成纖維細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的，這些成纖維細(xì)胞通過長(zhǎng)期過度產(chǎn)生使心肌變硬、損害心臟功能的纖維物質(zhì)來應(yīng)對(duì)心臟損傷和炎癥—這種情況稱為纖維化。研究結(jié)果顯示，在心力衰竭的小鼠模型實(shí)驗(yàn)中，由重新編程的T細(xì)胞引起的心臟成纖維細(xì)胞減少，導(dǎo)致纖維化的顯著逆轉(zhuǎn)。

圖片研究成果（圖源：Science）

在該項(xiàng)研究中，研究人員設(shè)計(jì)了一種mRNA，并將其封裝在CD5靶向的LNP顆粒中（稱為“靶向抗體/LNP-mRNA載體”或CD5/LNP –FAPCAR）。該mRNA編碼靶向成纖維細(xì)胞活化蛋白（FAP）的T細(xì)胞。研究人員首先進(jìn)行了概念驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在體外將含有編碼FAPCAR或綠色熒光蛋白（GFP）的修飾mRNA（封裝在CD5/LNP中）與新鮮分離的激活的鼠T細(xì)胞在體外培養(yǎng)48小時(shí)。通過流式細(xì)胞儀顯示，靶向CD5的LNP載體將其mRNA遞送至培養(yǎng)的大多數(shù)T細(xì)胞中。此外，這些LNP產(chǎn)生的CAR-T細(xì)胞能夠在體外以劑量依賴的方式有效地殺傷表達(dá)FAP的靶細(xì)胞。

CD5靶向的LNPs在體外產(chǎn)生功能性的基于mRNA的FAPCAR-T細(xì)胞（圖源：Science）

接下來，研究人員評(píng)估了CD5靶向的LNP-mRNA是否也可以在體內(nèi)有效地重編程T細(xì)胞。研究結(jié)果顯示，靜脈注射含有熒光素酶mRNA（CD5/LNP-Luc）的小鼠在其脾T細(xì)胞中表達(dá)豐富的熒光素酶，而注射同種型對(duì)照（非靶向）IgG/LNP-Luc的小鼠則沒有。生物發(fā)光成像技術(shù)顯示，僅在CD5/LNP-Luc處理的動(dòng)物中證明了脾臟的靶向性。

在另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，CD5/LNPs加載了編碼Cre重組酶（CD5/LNP-Cre）的mRNA，研究人員將其注射到Ai6 Cre-reporter小鼠中（Rosa26CAG-LSL-ZsGreen）。研究結(jié)果顯示，注射了CD5/LNP-Cre的動(dòng)物的CD3+T細(xì)胞（CD4+和CD8+亞群）中發(fā)現(xiàn)了基因重組（ZsGreen表達(dá)）的證據(jù)，但在CD3– （非T）細(xì)胞中或注射IgG/LNP-Cre的小鼠中幾乎沒有Cre重組酶活性的證據(jù)。之后，研究人員進(jìn)一步探究了靶向LNP是否可以將FAPCAR mRNA（CD5/LNP-FAPCAR）遞送至已建立的高血壓小鼠心臟損傷和纖維化模型的T細(xì)胞中。

LNP注射后48小時(shí)，研究結(jié)果顯示，僅在接受CD5/LNP-FAPCAR的小鼠中有相對(duì)穩(wěn)定的FAPCAR+T細(xì)胞群（17.5-24.7%）。相比之下，非靶向（IgG/LNP-FAPCAR）和含有GFP的靶向LNP（CD5/LNP-GFP）不產(chǎn)生FAPCAR T細(xì)胞。此外，研究人員沒有在脾B細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞中觀察到顯著的FAPCAR表達(dá)。注射后1周在脾T細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)FAPCAR的表達(dá)，表明該模型中FAPCAR表達(dá)的瞬時(shí)性質(zhì)。

CD5靶向的LNP在體內(nèi)產(chǎn)生基于mRNA的FAPCAR T細(xì)胞（圖源：Science）

研究人員接下來評(píng)估了CD5/LNP-FAPCAR治療是否能夠改善受傷小鼠的心臟功能。為了測(cè)試這一點(diǎn)，研究人員在通過28天滲透微型泵輸送AngII/PE的小鼠中誘導(dǎo)了心臟損傷，當(dāng)小鼠纖維化明顯時(shí)，靜脈注射10 μg LNP。研究結(jié)果顯示，體內(nèi)產(chǎn)生的瞬時(shí)FAPCAR T細(xì)胞治療的受傷小鼠的功能顯著改善，這與之前使用過繼轉(zhuǎn)移的病毒FAPCAR T細(xì)胞的研究一致。同樣與之前的研究一致，體重標(biāo)準(zhǔn)化的LV質(zhì)量（在M模式下估計(jì)）在CD5/LNP-FAPCAR注射后沒有顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異，盡管注意到與對(duì)照受傷小鼠相比有改善的趨勢(shì)。

此外，左室舒張功能（E / e?）恢復(fù)到未受傷的水平。研究人員通過射血分?jǐn)?shù)和整體縱向應(yīng)變測(cè)量，顯示左室收縮功能也顯著改善。研究人員通過用picrosirius red染色評(píng)估的組織學(xué)分析顯示，用CD5/LNP-FAPCAR治療的小鼠與用鹽水或IgG/LNP-FAPCAR對(duì)照治療的小鼠相比，細(xì)胞外基質(zhì)的總負(fù)荷顯著改善。因此，CD5/LNP-FAPCAR治療可改善功能并減少間質(zhì)纖維化。

小鼠體內(nèi)產(chǎn)生瞬時(shí)FAPCAR T細(xì)胞可改善損傷后的心臟功能（圖源：Science）

總之，在這項(xiàng)新研究中，研究人員設(shè)計(jì)了一種mRNA，并將mRNA封裝在納米顆粒LNP中，注射到小鼠體內(nèi)，封裝的mRNA分子被T細(xì)胞吸收，有效地重新編程T細(xì)胞以攻擊活化的成纖維細(xì)胞。然而，這種重新編程是非常瞬時(shí)的。mRNA沒有整合到T細(xì)胞DNA中，在T細(xì)胞內(nèi)僅存活幾天之后T細(xì)胞恢復(fù)正常，不再靶向成纖維細(xì)胞。更重要的是研究人員發(fā)現(xiàn)，盡管活動(dòng)持續(xù)時(shí)間很短，但注射mRNA成功地重新編程了大量小鼠T細(xì)胞，導(dǎo)致動(dòng)物的心臟纖維化顯著減少，并恢復(fù)了正常的心臟大小和功能。

參考資料：

[1]Rurik JG, Tombácz I, Yadegari A, et al. CAR T cells produced in vivo to treat cardiac injury. Science. 2022 Jan 7;375（6576）:91-96. doi:10.1126/science.abm0594. Epub 2022 Jan 6. PMID: 34990237.

（原文有刪減）

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