編譯丨范東東

創(chuàng)新型的細(xì)胞療法、基因療法有望徹底改變傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的想象，滿足未滿足的臨床需求并提供持久性治愈的可能。因此，該領(lǐng)域也引起了廣大制藥廠商的熱情和興趣，市場規(guī)模的復(fù)合年增長率高達(dá)54%。

EvaluatePharma預(yù)計，到2026年，該領(lǐng)域市場價值將達(dá)到590億美元。然而，制造這些復(fù)雜革命性新療法的難度非常大，其中的下游加工環(huán)節(jié)更是頗具挑戰(zhàn)。

圖1：細(xì)胞、基因、再生和核酸治療產(chǎn)品當(dāng)前和預(yù)測銷售額（2020-2026年）

資料來源：EvaluatePharma，2021年7月

01基因治療產(chǎn)品

市場上目前已有多種基因療法獲批。通常來說，使用病毒載體是向基因治療產(chǎn)品的首選途徑，最常見的三種基因治療載體分別是腺病毒、腺相關(guān)病毒（AAV）和慢病毒（LV）。

表1：獲得許可的基因治療產(chǎn)品

表2：基因療法常見的病毒載體

常見的病毒基因療法包括以下兩種：

體內(nèi)基因治療

使用病毒載體將基因引入患者體內(nèi)的細(xì)胞并傳遞相應(yīng)的基因。這種方法通常是為了增加或替換低水平轉(zhuǎn)基因編碼的蛋白質(zhì)，Luxturna和Zolgensma是采用體內(nèi)基因治療的代表性療法。

離體基因治療

從患者身上提取細(xì)胞并用病毒載體處理，再將基因傳遞給提取的細(xì)胞，然后將這些修飾過的細(xì)胞輸注回患者體內(nèi)。嵌合抗原受體CAR-T療法普遍采用這種方法（比如Kymriah），通常使用慢病毒將基因傳遞給患者T細(xì)胞。使用蛋白質(zhì)生物分子（如抗體），可以在氨基酸水平評估分子結(jié)構(gòu)，并且可以同時確定色譜樹脂的精確結(jié)合位置。然而，使用病毒載體導(dǎo)致了制造工藝需要有更高級別的復(fù)雜性。病毒載體由數(shù)十到數(shù)百個單獨(dú)的蛋白質(zhì)組成的納米粒子，而這些蛋白質(zhì)以獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)排列組合。

綜合來看，所有病毒基因療法的制造難度和下游挑戰(zhàn)都是相似的，具體取決于所使用的病毒載體類型，以及所傳遞的基因編碼和治療類型（體內(nèi)或體外）。與單純的蛋白質(zhì)產(chǎn)品相比，制備復(fù)雜的基因療法還需要考慮病毒載體的大小和復(fù)雜性。

02下游純化的挑戰(zhàn)

目前，有許多療法主要針對罕見疾病，使用病毒載體治療較小規(guī)模的患者群體。傳統(tǒng)上，純化策略更加專注于病毒大小和密度特性，涉及使用密度梯度超速離心等。AAV純化的典型過程十分復(fù)雜，需要利用空衣殼（1.32g/cm3）和完整衣殼（1.40g/cm3）之間的微小密度差異，通過超速離心的方法將空衣殼（非活性）與含轉(zhuǎn)基因衣殼活性分離。這一步驟非常耗時（數(shù)小時），而且需要重復(fù)進(jìn)行多次，才能達(dá)到所需的衣殼分辨率。此外，用于形成梯度的化學(xué)制品（如氯化銫）價格昂貴，而且分離完成后還需要從最終產(chǎn)品中去除這部分雜質(zhì)，并且整個處理過程是人工密集型產(chǎn)業(yè)，難以用機(jī)械自動化取代。

圖2：AAV純化的典型過程

制備過程的困難導(dǎo)致了基因治療產(chǎn)品的售價往往相當(dāng)高昂（比如Zolgensma治療成本高達(dá)210萬美元），使其僅適用于需要小劑量病毒載體的情況。治療其他單基因疾?。ㄈ缪巡?、杜氏或帕金森?。?，需要更多可擴(kuò)展的純化方法。

目前，研發(fā)人員已經(jīng)通過多級色譜法技術(shù)，構(gòu)建病毒載體下游加工的替代方法來解決這一問題。在制備過程中，清除宿主細(xì)胞成分（蛋白質(zhì)、核酸）以及控制與所需產(chǎn)品相關(guān)的物種都是十分必要的，此外過程中還需要從含有轉(zhuǎn)基因的衣殼中分離出空衣殼。

03病毒載體層析

1、病毒載體的色譜矩陣

蛋白質(zhì)純化通常使用多孔顆粒形式的層析介質(zhì)，通過對流流動使蛋白質(zhì)純化珠表面可以被吸附。蛋白質(zhì)純化珠的孔徑為15至40nm，吸附的病毒載體將被限制在蛋白質(zhì)純化珠表面，進(jìn)而導(dǎo)致容量遭到了限制。雖然可以增加蛋白質(zhì)純化珠的孔徑，但這將會降低蛋白質(zhì)純化珠的結(jié)構(gòu)完整性，使其難以裝入色譜柱。使用色譜固定相的替代形式也可用于病毒載體，包括離子交換、疏水相互作用、混合模式等。這些替代形式不受孔徑擴(kuò)散問題的影響。

2、病毒載體的親和層析

基于蛋白A與IgG分子Fc區(qū)結(jié)合的親和層析是一種高效的捕獲機(jī)制，適用于所有單克隆抗體（mAb）產(chǎn)品，并且能夠制造出純度高于98%的產(chǎn)品。該平臺過程適用于單克隆抗體的開發(fā)制造及分離，目前已開發(fā)出可結(jié)合特定AAV血清型（8,9）或血清型組（1至5,1至9）的親和配體。然而，AAV需要在中性pH值下進(jìn)行結(jié)合，而洗脫過程則需要將pH值降低至2至3。洗脫過程也需要嚴(yán)格控制，盡量減少AAV處于低pH值的時間，避免AAV載體發(fā)生失活。

3、空/全衣殼分辨率

除了完整衣殼和空衣殼之間的密度差異外，空衣殼的等電點(diǎn)（pI）也存在電荷差異，與完整衣殼相差0.4個pH單位。最佳的條件是在色譜模式pH值約為9的情況下進(jìn)行陰離子交換，空衣殼會比完整衣殼更早洗脫。然而，對于制備工藝來說，該過程所需的梯度長度（100CV）是不切實際的，但在確定了空殼和滿殼的洗脫條件后，轉(zhuǎn)換為階梯梯度可以為衣殼分辨率提供可擴(kuò)展的制造方法。

4、病毒載體大小

與來自宿主細(xì)胞的其他物種（例如蛋白質(zhì)和核酸酶消化后的核酸片段）相比，病毒載體的大小意味著切向流過濾可以實現(xiàn)從宿主細(xì)胞雜質(zhì)中有效地純化病毒載體。因此需要研發(fā)和使用新型的緩沖液，使其滿足避免病毒載體聚集的同時，能夠減少宿主細(xì)胞成分與病毒載體結(jié)合。

04前景

在證明了病毒載體可以為未滿足的醫(yī)療需求帶來臨床療效之后，制造下游面臨的主要挑戰(zhàn)是通過可擴(kuò)展的工藝來降低制造成本，同時提供治療所需的高質(zhì)量療法產(chǎn)品。盡管目前存在相應(yīng)的解決途徑，但仍需要進(jìn)一步完善和開發(fā)。

其中，血清型依賴就是AAV當(dāng)前面臨的主要挑戰(zhàn)之一。由于臨床應(yīng)用中需要使用不同的血清型來靶向定位患者不同的細(xì)胞或組織，因此開發(fā)適用于各種AAV血清型的穩(wěn)健純化平臺仍然是一個需要解決的目標(biāo)。此外，在簡化病毒載體下游工作流程中，需要進(jìn)行突破的領(lǐng)域還包括對全衣殼均具有選擇性的樹脂開發(fā)。

05基因治療的新模式

目前，基因遞送領(lǐng)域有兩個熱點(diǎn)一直受到研發(fā)領(lǐng)域的關(guān)注。

第一個是使用細(xì)胞外囊泡（外泌體）做為治療載體。該載體可以穿過血腦屏障，這也是目前其他遞送方法無法實現(xiàn)的。外泌體做為潛在療法的純化，遇到的難題是如何與其他細(xì)胞外囊泡的分離。

第二個關(guān)注領(lǐng)域是信使RNA（mRNA）。在新冠疫苗中的成功使用加速了mRNA療法和脂質(zhì)納米顆粒（LNP）遞送機(jī)制的發(fā)展。mRNA療法制備過程中，下游的挑戰(zhàn)與分子大小有關(guān)，mRNA療法的制造過程與病毒載體有很大不同，mRNA需要在DNA的基礎(chǔ)上進(jìn)行基于酶的分子合成。

06總結(jié)

目有超過1000種療法正在研發(fā)當(dāng)中，而這一事實也證明了在很長一段時間內(nèi)，制藥廠商對細(xì)胞和基因療法仍將存在極大的興趣和熱情。

然而，為了實現(xiàn)持久性治愈的承諾，研發(fā)人員還需要密切關(guān)注和解決制造流程中的種種難題，進(jìn)一步改善當(dāng)前前沿療法高昂的成本和可用性問題。未來，制藥廠商如果能夠在下游純化領(lǐng)域進(jìn)行突破改進(jìn)，將為實現(xiàn)這一目標(biāo)做出重大貢獻(xiàn)。

編譯原文：Challenges in downstream purification of advanced therapies

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