2024-03-04 17:38:10來源：鼎泰瀏覽量：989
siRNA 藥物合成路徑和雜質(zhì)來源
與小分子化學藥物不同，siRNA 藥物具有更大的分子量和更復雜的化學結構，其研發(fā)和生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)也異常復雜。如何科學評估siRNA藥物雜質(zhì)的影響和合理控制其限度，是業(yè)界亟待探索的重要課題。
眾所周知，siRNA主要是通過固相合成（solid-phase synthesis，SPS），常伴隨產(chǎn)生多種工藝相關（如起始原材料、中間體、配體和保護基團殘留等）或產(chǎn)品相關雜質(zhì)（與活性成分結構接近的副產(chǎn)物），這些雜質(zhì)可能會對siRNA藥物的質(zhì)量和安全性造成潛在影響。
siRNA 藥物雜質(zhì)研究遵循的指導原則
siRNA藥物相關的有機雜質(zhì)、無機雜質(zhì)、殘留溶劑和元素雜質(zhì)等可遵照ICH Q3系列指導原則；考慮到與常規(guī)化學藥物之間的差異，siRNA藥物產(chǎn)品相關的雜質(zhì)的報告限度（Reporting threshold）、鑒定限度（Identification threshold）和界定限度（Qualification threshold）不能完全按照ICH Q3A確定。因此，對siRNA藥物各類雜質(zhì)水平的科學控制尤為關鍵。
siRNA 藥物雜質(zhì)研究的考量因素
1
對于雜質(zhì)研究的化學考量
? 雜質(zhì)表征
對產(chǎn)品相關雜質(zhì)的表征是任何新化學實體開發(fā)過程中的一項重要工作，需以對合成工藝、起始物料和潛在降解途徑的詳盡評估為指導。由于siRNA 藥物的平臺特性，基于一個分子上獲得的信息可用于指導其他分子的雜質(zhì)研究，減少重復性工作。對于已有充分文獻報道的雜質(zhì)，對表征研究的要求較低；對于首次報道的雜質(zhì)，則需要更全面的數(shù)據(jù)支持其表征研究。對于由多個成分構成的混合雜質(zhì)，通常不需要逐一解析不同成分的結構。有一句老話 “A day in the library saves a month in the laboratory”用來形容siRNA 藥物雜質(zhì)研究特別貼切。
? 分析方法
應盡可能開發(fā)能有效分離雜質(zhì)與siRNA藥物序列以及不同雜質(zhì)的分析方法，如毛細管凝膠電泳法（CGE）、陰離子交換色譜等。近年來，離子對高效液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜聯(lián)用（IP-HPLC-ESI-MS）技術的應用日益廣泛。對雙鏈siRNA藥物，除了分析單個單鏈外，還需要在非變性條件下進行分析，以將殘留單鏈和聚集體與siRNA藥物雙鏈進行分離和定量。
? 雜質(zhì)報告
與小分子化藥一樣，siRNA 藥物的質(zhì)量標準中也需列明特定雜質(zhì)和非特定雜質(zhì)。前者有助于評價生產(chǎn)工藝中特定步驟或控制策略的成效，如單鏈寡核苷酸通常含有較低水平的 n - 1 雜質(zhì)，其水平在很大程度上取決于固相合成工藝中脫苯甲基步驟是否成功?？紤]到siRNA 藥物雜質(zhì)難以全部有效分離，特定雜質(zhì)常需要以組的形式報告，如將n-1或n+1的所有組分歸為一組。
對于大多數(shù)小分子藥物，報告限度設定為0.05%或 0.03%。鑒于分離和分析方法的局限性，目前尚沒有形成廣泛接受的寡核苷酸藥物的報告限度、鑒定限度和界定限度。在大多數(shù)情況下，設置0.2% 的報告限度、1.0% 的鑒別限度和1.5%的界定限度可能是適用的。
2
對于雜質(zhì)研究的安全性考量
對于雜質(zhì)安全性角度的考量主要集中在對雜質(zhì)界定的定義上。對于小分子化藥，雜質(zhì)界定被定義為“獲得和評價某些數(shù)據(jù)的過程，這些數(shù)據(jù)可用于確保單個雜質(zhì)或在特定的含量下的一系列雜質(zhì)的生物安全性”[2]。根據(jù)ICH Q3A，對于一個通過充分的非臨床安全性研究和臨床研究的新原料藥，其任一雜質(zhì)的水平已經(jīng)得到合理界定。對于動物/人體中的重要代謝物的雜質(zhì)，通常也視為已通過界定。如果雜質(zhì)的界定水平（Qualified level）高于告訴實際所含的雜質(zhì)量（質(zhì)量標準限度，Specification limit），同樣可以根據(jù)完成的安全性研究中使用的實際雜質(zhì)量來判斷其合理性（圖1）。
圖1. 安全性數(shù)據(jù)（Qualified Level）、質(zhì)量標準限度（Specification Limit）、鑒定限度（Identification Threshold）和界定限度（Qualification Threshold）的關系[1]
如果無法獲得足夠數(shù)據(jù)支持擬定的限度且超過界定限度，則必須開展進一步研究以支持該限度的合理性。對于某些藥物，可以根據(jù)科學原理和認知水平（如藥物的類別和臨床經(jīng)驗），對其雜質(zhì)界定限度進行適當調(diào)整?？傊瑢ο薅鹊拇_定應具體情況具體分析。上述基本原則同樣適用于siRNA 藥物。
siRNA 藥物雜質(zhì)界定研究策略
1
識別雜質(zhì)類別
根據(jù)結構，可將雜質(zhì)分為四類，每類雜質(zhì)的安全評估要求不同：
Class I：與siRNA藥物序列相同的代謝產(chǎn)物類雜質(zhì)，如缺少末端堿基的雜質(zhì)，其安全性已在非臨床評價中確立，不需要進一步評估。
Class II：僅含天然核酸中存在的結構元素的雜質(zhì)，如磷酸二酯雜質(zhì)，可以視為安全，不需要進一步評估。
Class III：與siRNA藥物序列不同但不含新結構元素的雜質(zhì)，如n-1、n+1，單個雜質(zhì)水平很難達到危害水平，一般不需要動物試驗。
Class IV：含siRNA藥物和天然核酸都不具有的新結構元素的雜質(zhì)，若其限量超過1.5%的界定限度時，需進行非臨床安全性研究。
2
非臨床評價設計
為了對Class IV類雜質(zhì)進行界定而進行非臨床研究時，動物種屬、供試品、研究周期和劑量水平是重要的設計要素。
動物種屬：與ICH Q3A中給出的建議一致，該研究可僅在一種嚙齒類動物中進行。
供試品：盡管選擇生產(chǎn)僅含有雜質(zhì)或雜質(zhì)混合物的樣品是可以接受的，通常更傾向于使用由摻入了相關雜質(zhì)的siRNA藥物，主要是因為：1）生產(chǎn)富含雜質(zhì)的siRNA藥物往往比生產(chǎn)單純的雜質(zhì)更實用；2）在siRNA 藥物存在的情況下，評估雜質(zhì)的安全性更能代表雜質(zhì)在患者中暴露的真實情況。
許多常見siRNA 藥物雜質(zhì)，例如 abasic 和 CNET 雜質(zhì)，均為單個成分組成的混合物，它們之間的區(qū)別僅在于序列中的位置。對于該類雜質(zhì)，評估其中的一個代表性雜質(zhì)通常足夠，但評估同一類雜質(zhì)的混合物也是允許的，而且由于合成方面的考慮，有時實際上也是不可避免的。根據(jù)經(jīng)驗，最有效的雜質(zhì)評估方法是采用盒式設計（Cassette maner），將siRNA 藥物與一種以上的雜質(zhì)配比混合后共同給藥。
研究周期：一般來說，研究周期應足以確保在值得關注的組織中達到穩(wěn)態(tài)濃度。對半衰期較長、計劃長期使用的siRNA，可能需要長達13周的給藥（表1）；對于在組織中半衰期較短或不計劃長期使用的siRNA，可以短期給藥。給予的雜質(zhì)的量應等于或超過期望的覆蓋水平。
劑量水平：建議至少設置2個劑量水平，低劑量應為預期的NOAEL，高劑量應擴大治療窗口或足以產(chǎn)生與siRNA 藥物一致的毒理學效應。除了摻雜的供試品組外，還應設置給予供試品或溶媒的對照組。每組動物數(shù)應足夠，如10只/性別/組。
表1. 小鼠重復給藥13周雜質(zhì)界定試驗設計[1]
3
毒理學評估
毒理學評估的指標應包括：in-life 觀察（如體重、攝食量、臨床觀察和眼科檢查）、臨床病理（包括血液學和血清生化等）、大體解剖、器官重量和組織病理學檢查；還應檢測siRNA在組織中的濃度，以評估暴露情況。
4
計算毒理學覆蓋范圍
在研究中產(chǎn)生的毒理數(shù)據(jù)可以用來計算，主要有兩種方法。一種簡單的方法是將供試品中雜質(zhì)百分比設為覆蓋率，如安全劑量大于或等于臨床劑量，該方法是有效的；另一種更為靈活的方法是計算適當劑量下供試品中實際存在的雜質(zhì)量，以相對于臨床劑量的百分比表示，作為覆蓋范圍（表2）。
表2.計算毒理學覆蓋范圍的可能方法[1]
5
siRNA藥物雜質(zhì)界定決策樹
對于小分子化學藥而言，降低雜質(zhì)含量使其低于限度通常要比提供雜質(zhì)的安全性數(shù)據(jù)來得簡單。根據(jù)ICH Q3A中的推薦的決策樹，當雜質(zhì)含量超過限度且已有信息不足以提示其安全性時，應考慮進行額外的安全性試驗。如何合理地界定一個雜質(zhì)將取決于許多因素，包括患病人群、每日劑量、給藥途徑與療程。
對于siRNA藥物來說，通過工藝優(yōu)化進行雜質(zhì)水平的控制可能同樣是適用的，只不過限于固相合成工藝的特殊性和生產(chǎn)成本方面的考慮可能需要綜合研判。對于siRNA藥物雜質(zhì)的界定決策樹，有其自身的特殊之處，主要體現(xiàn)在觸發(fā)雜質(zhì)界定研究的條件和邏輯不完全相同、需要開展的界定試驗也不相同。
已上市 siRNA 藥物雜質(zhì)控制案例分析
結語
大部分siRNA藥物相關雜質(zhì)主要包括與起始物料、生產(chǎn)工藝等相關的雜質(zhì)，建議對雜質(zhì)進行歸類和報告。鑒于檢測方法的限制，siRNA 藥物雜質(zhì)的報告限度、鑒定限度和界定限度采用高于ICH Q3A中的相應水平可能是合理的。對于含有在siRNA原形藥物或天然核酸中所沒有的結構元素的雜質(zhì)，需要進行非臨床安全性評價。在嚙齒類動物重復給藥毒性試驗中，可伴隨進行雜質(zhì)安全性評估。毒理批次的雜質(zhì)譜宜涵蓋臨床批次的雜質(zhì)譜。
本文綜合相關指南、文獻資料及FDA 已批準上市siRNA 藥物的案例分析，就siRNA藥物雜質(zhì)問題提供了一定的科學建議，旨在確保藥物的質(zhì)量和安全性，并指導非臨床研究設計和助力臨床轉化。
參考資料：
[1] Daniel Capaldi, Andy Teasdale, Scott Henry, et al. Impurities in Oligonucleotide Drug Substances and Drug Product. NUCLEIC ACID THERAPEUTICS. 2017
[2] ICH Q3A(R2). Impurities in New Drug Substances. https://www.ich.org/page/quality-guidelines
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