在他山之石系列文章-1中，鼎泰集團(tuán)對(duì)第1款 siRNA 藥物 Patisiran（Onpattro?）的上市歷程及臨床開發(fā)路徑進(jìn)行了復(fù)盤分析（點(diǎn)擊查看原文），為我們清晰、全面地呈現(xiàn)了一款 siRNA 藥物如何從非臨床向臨床轉(zhuǎn)化，以及借助無(wú)縫銜接的臨床研發(fā)策略在 IND 后的短短 6 年內(nèi)獲批上市的經(jīng)典案例。
在他山之石系列文章-2中，在對(duì)第2款已上市siRNA 藥物 — Givosiran（Givlaari?） 的上市歷程及臨床開發(fā)路徑進(jìn)行復(fù)盤分析的同時(shí)，增加了更多與臨床轉(zhuǎn)化有關(guān)的內(nèi)容，以期為指導(dǎo) siRNA 藥物的非臨床研究、運(yùn)用臨床前研究結(jié)果支持臨床開發(fā)，以及全局視角的研發(fā)策略的制定提供參考和啟發(fā)。
推文發(fā)出后，很多熱心專家和老師在后臺(tái)積極互動(dòng)，并提出了許多寶貴的意見和建議，這激勵(lì)我們團(tuán)隊(duì)有必要對(duì)前期內(nèi)容進(jìn)行進(jìn)一步的補(bǔ)充和改進(jìn)。在此，鼎泰團(tuán)隊(duì)特別感謝關(guān)注我們成長(zhǎng)和努力的朋友們和老師們。
本次更新的內(nèi)容主要包括：進(jìn)一步細(xì)化了FIH 起始劑量的設(shè)計(jì)依據(jù)，補(bǔ)充了代謝產(chǎn)物評(píng)估以及藥代動(dòng)力學(xué)和免疫原性檢測(cè)相關(guān)的內(nèi)容。
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| 藥代動(dòng)力學(xué)和免疫原性檢測(cè) |
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Givosiran是由 Alnylam Pharmaceuticals 開發(fā)的首個(gè) GalNAc 偶聯(lián)的 siRNA 藥物（GalNac-siRNA），能夠特異性遞送至肝臟細(xì)胞并靶向降解編碼ALAS1蛋白的 mRNA，從而降低神經(jīng)毒性前體 δ -氨基乙酰丙酸（ALA）和膽色素原（PBG）的水平，減少疾病發(fā)作[1]。
2015年8月13日，Givosiran 向FDA提交了首個(gè)IND申請(qǐng)。2019年11月20日，在提交NDA申請(qǐng)后的不足4個(gè)月（比預(yù)期的PUDUFA時(shí)間提前了近3個(gè)月）內(nèi)即獲得FDA批準(zhǔn)用于治療成人急性肝卟啉癥（AHP）。然后分別于2020年3月2日和2021年6月23日獲得 EMA 和 PMDA 批準(zhǔn)上市。該適應(yīng)癥的批準(zhǔn)是基于關(guān)鍵性III 期臨床試驗(yàn)（NCT03338816，代號(hào)ENVISION）的積極結(jié)果。Givosiran的成功上市不僅為AHP患者帶來了新的治療選擇，也為RNAi技術(shù)在治療罕見疾病領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的范例。
AHP 是由于血紅素生物合成途徑中第3個(gè)[表現(xiàn)為急性間歇性肝卟啉癥（AIP）]、第6個(gè)[家族性卟啉原卟啉酸尿癥（HCP）]或第7個(gè)[變異卟啉?。╒P）]酶的常染色體顯性失活，或在非常罕見的情況下，由常染色體隱性遺傳導(dǎo)致的一種罕見、嚴(yán)重、可能危及生命的遺傳性疾病。這些染色體的異常變化導(dǎo)致 ALA 和 PBG 的積累，進(jìn)而導(dǎo)致急性卟啉癥發(fā)作，主要表現(xiàn)為腦脊髓與交感神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀，如腹痛（主要癥狀）、急性神經(jīng)病變等。大多數(shù)有癥狀的患者在其一生中很少發(fā)作，然而，也有8 %的患者會(huì)出現(xiàn)病情加重，反復(fù)發(fā)作（≥ 4次/年）。最常見的急性肝卟啉癥是 AIP，其患病率估計(jì)為5.4 /百萬(wàn)人。靜脈注射血紅素是當(dāng)時(shí)歐盟和美國(guó)推薦的用于 AHP 急性發(fā)作的治療方案。然而，使用血紅素治療還有諸多限制，除了在水溶液中不穩(wěn)定外，還包括重復(fù)給藥可能引起的潛在毒性，如靜脈血栓性靜脈炎、速效耐藥性、凝血異常和繼發(fā)性鐵負(fù)荷等。因此，迫切需要更加安全、有效的治療方案來應(yīng)對(duì)急性肝卟啉癥的發(fā)作并減少長(zhǎng)期并發(fā)癥。
無(wú)縫銜接、駕輕就熟的臨床開發(fā)路徑是 Givosiran 成功上市的重要支撐。1項(xiàng)I期劑量/給藥頻率探索試驗(yàn)、1項(xiàng)無(wú)縫銜接的I/II 期開放標(biāo)簽擴(kuò)展（OLE）試驗(yàn)和1項(xiàng)III期關(guān)鍵性臨床試驗(yàn)為 Givosiran 的NDA申請(qǐng)和獲批上市提供了充分的臨床數(shù)據(jù)支持。
Ⅰ 期臨床試驗(yàn)
（NCT02452372，跨地區(qū)多中心）
2015年，Givosiran 的首次人體試驗(yàn)（FIH）啟動(dòng)。這是1項(xiàng)多中心、隨機(jī)、安慰劑對(duì)照的劑量遞增試驗(yàn)，旨在評(píng)估 Givosiran 在 AIP 患者中的安全性、耐受性及藥代動(dòng)力學(xué)/藥效動(dòng)力學(xué)特征。
Ⅰ 期試驗(yàn)臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)
試驗(yàn)分3部分進(jìn)行，共入組了40人，均為皮下注射給藥：
A和B部分共入組23人。其中，A部分（SAD；0.035、0.10、0.35、1.0、2.5 mg/kg，42天）和B部分（MAD；QM，0.35、1.0 mg/kg，70天）為單盲試驗(yàn)，受試者為尿ALA和PBG水平升高但近期未發(fā)作（定義為在給藥前6個(gè)月內(nèi)沒有發(fā)作）的 AIP 患者
C部分（2.5、5.0 mg/kg，Q3M或QM）入組17人，采用雙盲設(shè)計(jì)，受試者為反復(fù)發(fā)作的 AIP 患者
主要終點(diǎn)為給藥后發(fā)生 AEs、SAEs及中斷用藥的受試者比例；次要終點(diǎn)為 Givosiran 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（Cmax、tmax、t1/2、AUC）以及對(duì)尿中ALA和PBG水平的影響。起始劑量設(shè)計(jì)是從非臨床研究向臨床轉(zhuǎn)化的第一步。本試驗(yàn)中起始劑量主要依據(jù)：◆ 非臨床藥效學(xué)數(shù)據(jù)（點(diǎn)擊查看往期內(nèi)容）：
（1）大鼠AIP模型中，Givosiran 以0.3、1或3 mg/kg（QW*4）皮下注射給藥后，可劑量依賴性降低 ALAS1 mRNA 水平，同時(shí)伴隨著尿液中 ALA 和 PBG 水平的下降；
（2）小鼠AIP模型中，Givosiran 在 1 mg/kg 劑量下，血清 ALA 和 PBG 水平分別降低80% 和 68%；
（3）食蟹猴模型中，Givosiran 以1 mg/kg 皮下注射給藥后，ALAS1 mRNA 水平僅降低20%。根據(jù)申請(qǐng)人前期開發(fā)的產(chǎn)品Revusiran（ALN-TTRSC siRNA）的經(jīng)驗(yàn)，從NHP到人按1:1 進(jìn)行劑量外推，認(rèn)為0.10 mg/kg 為Givosiran無(wú)藥理活性劑量。
Givosiran非臨床藥效部分?jǐn)?shù)據(jù)
◆ 非臨床毒理學(xué)數(shù)據(jù)：
根據(jù)大鼠和食蟹猴重復(fù)給藥毒理學(xué)試驗(yàn)中確定的 NOAEL 計(jì)算安全系數(shù)，最終采信了相對(duì)保守的基于 BSA 估算的安全系數(shù)。基于以上非臨床研究結(jié)果，申請(qǐng)人在最初的臨床方案中確定的FIH 起始劑量為 0.10 mg/kg。在完成0.10 和 0.35 mg/kg 劑量組的入組后，增加了更低的0.035 mg/kg 劑量，筆者尚未查到具體原因。如有專家有相關(guān)信息，敬請(qǐng)不吝指正。研究結(jié)果顯示，對(duì)反復(fù)發(fā)作的 AIP 患者，經(jīng) QM 給藥后的主要AEs均為輕度 AEs；可降低 ALAS1 mRNA 水平，ALA和PBG的水平接近正常，發(fā)作率低于安慰劑組[2]。采用經(jīng)驗(yàn)證的 LC-MS/MS 方法檢測(cè)了血漿中 Givosiran（詳細(xì)的方法學(xué)內(nèi)容詳見后文）。0.035 和 0.1 mg/kg 劑量組血漿中 Givosiran 濃度均低于定量下限；0.35~5.0 mg/kg劑量范圍內(nèi)，Givosiran 呈線性藥代動(dòng)力學(xué)特征，Tmax為0.5~5 h，24 h 內(nèi)血漿濃度迅速下降，t1/2為4~10 h。◆ 代謝產(chǎn)物安全性評(píng)估：
對(duì)于siRNA藥物的代謝產(chǎn)物是否需要進(jìn)行檢測(cè)，以及如何評(píng)估代謝產(chǎn)物的安全性一直是業(yè)界思考和關(guān)注的問題。本文著重對(duì)Givosiran及其代謝產(chǎn)物的非臨床和臨床研究結(jié)果進(jìn)行了分析，或許能為寡核苷酸藥物代謝產(chǎn)物的評(píng)價(jià)提供一定的參考。AS 3′( N-1 )是Givosiran主要的代謝物（>總物質(zhì)的10%），在血漿中迅速形成，臨床結(jié)果顯示AS 3′( N-1) tmax為1-8 h，t1/2 與 Givosiran 相當(dāng)，在人體內(nèi)具有一定的暴露水平。通過與重復(fù)給藥 13 周毒性試驗(yàn)中暴露量的比較發(fā)現(xiàn)，NOAEL劑量下AS 3′( N-1)的暴露量遠(yuǎn)高于臨床有效劑量下的暴露量，因此未開展額外的代謝產(chǎn)物研究。
Ⅰ 期試驗(yàn)安全性和藥代動(dòng)力學(xué)（含代謝產(chǎn)物檢測(cè)）研究結(jié)果
Ⅰ/Ⅱ 期臨床試驗(yàn)（NCT02949830）
2016年，啟動(dòng)了 Ⅰ/Ⅱ 期臨床試驗(yàn)。這是1項(xiàng)多中心、開放標(biāo)簽擴(kuò)展（OLE）研究，旨在評(píng)估皮下注射 Givosiran 的長(zhǎng)期安全性和臨床活性，受試者為16名已完成前述I期臨床試驗(yàn)（NCT02452372）C部分的 AIP 患者。主要終點(diǎn)為截至 49 個(gè)月時(shí)的 AEs 發(fā)生率；次要終點(diǎn)為截至 48 個(gè)月時(shí)尿液中 ALA 和 PBG 水平的變化、卟啉病發(fā)作的頻率和特點(diǎn)以及截至 49 個(gè)月時(shí)血紅素給藥情況的變化。
Ⅰ/Ⅱ OLE 期臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)
該試驗(yàn)給藥劑量為2.5 mg/kg，QM皮下注射。根據(jù) Ⅰ 期臨床試驗(yàn)結(jié)果，Givosiran 2.5 mg/kg 單次給藥耐受性良好，但沒有完全使 ALA 和 PBG 水平正?；籊ivosiran 2.5 mg/kg Q3M給藥顯示一定的臨床活性，但部分患者在治療期間仍持續(xù)出現(xiàn)嚴(yán)重卟啉病發(fā)作，這提示需要更高的給藥劑量。研究結(jié)果顯示，Givosiran 2.5 mg/kg 安全性良好，大多數(shù)AEs為輕度至中度；長(zhǎng)期使用 Givosiran 使 ALA 和 PBG 水平持續(xù)降低，沒有卟啉癥發(fā)作和不需要使用血紅素的患者比例隨著時(shí)間推移增加；安全性和有效性結(jié)果與下文所述的 Ⅲ 期臨床試驗(yàn)（ENVISION）的結(jié)果一致[3]。
Ⅲ 期臨床試驗(yàn)
（NCT03338816，代號(hào)ENVISION）
2017年，1項(xiàng)隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照的6個(gè)月多中心 Ⅲ 期臨床試驗(yàn)啟動(dòng)（雙盲期后進(jìn)行30個(gè)月開放標(biāo)簽擴(kuò)展試驗(yàn)）。該研究共完成36個(gè)月的數(shù)據(jù)分析，旨在評(píng)估 Givosiran 治療急性肝卟啉病患者的療效和安全性，受試者共94人。ENVISION 試驗(yàn)在18個(gè)國(guó)家/地區(qū)的36個(gè)研究地點(diǎn)進(jìn)行研究，是AHP進(jìn)行的最大規(guī)模的治療研究。
ENVISION試驗(yàn)中給藥劑量為 2.5 mg/kg（QM），劑量設(shè)計(jì)主要基于對(duì)前期試驗(yàn)結(jié)果的考量：相較于 Q3M，QM 給藥使尿中 ALA 的降低程度更高且持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，且該降低與卟啉病發(fā)作、血紅素使用和無(wú)發(fā)作間隔的顯著減少相關(guān)聯(lián)。主要終點(diǎn)為需要住院、緊急醫(yī)療就診或在家接受靜脈血紅素治療的卟啉病發(fā)作的年化發(fā)作率（AAR）；次要終點(diǎn)為3、6個(gè)月時(shí)尿ALA水平，6個(gè)月時(shí)尿PBG水平、血紅素使用的比例、簡(jiǎn)明疼痛量表（BPI-SF）及 SF-12 健康調(diào)查量表等。ENVISION試驗(yàn)獲得了支持Givosiran用于AHP治療的有效性證據(jù)[4]：主要終點(diǎn)：Givosiran治療（≤ 36個(gè)月）導(dǎo)致急性間歇性卟啉病癥狀持續(xù)改善，沒有發(fā)作的患者比例增加。
次要終點(diǎn)：尿中 ALA、PBG 水平在整個(gè)治療期持續(xù)降低；隨著時(shí)間的推移，沒有發(fā)作或不需要使用血紅素的患者比例增加；Givosiran 具有良好的安全性，且患者在身體/心理健康和生活質(zhì)量方面顯示出持續(xù)改善。
ENVISION試驗(yàn)有效性研究結(jié)果
除了成功的臨床開發(fā)計(jì)劃外，Givosiran 驚人的上市歷程還受益于與監(jiān)管機(jī)構(gòu)的有效溝通。基于Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果，Alnylam 于2017年6月14日申請(qǐng)召開 Pre-Phase 3會(huì)議（此時(shí)I/II 期 OLE 試驗(yàn)已啟動(dòng)），主要就擬開展的 Ⅲ 期試驗(yàn)設(shè)計(jì)征求 FDA 的建議。FDA 認(rèn)為申請(qǐng)人提出的劑量設(shè)計(jì)以及主要/次要終點(diǎn)是合理的，建議考慮將接受 Givosiran 治療的 AHP 患者的患者報(bào)告結(jié)局（Patient Reported Outcomes，PRO）的改善作為一個(gè)關(guān)鍵終點(diǎn)。通過本次溝通交流獲得的建議，使ENVISION 試驗(yàn)的有效性結(jié)果更快地獲得了FDA的認(rèn)可。
Pre-Phase 3 會(huì)議部分溝通問題和建議
此外，在從IND和NDA的過程中，還有一系列其他的監(jiān)管互動(dòng)，如ODD、BTD、B類會(huì)議、優(yōu)先審評(píng)等。監(jiān)管里程碑關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)
藥代動(dòng)力學(xué)和免疫原性檢測(cè)
pre-NDA 會(huì)議中，F(xiàn)DA 問及免疫原性對(duì)暴露、療效和安全性的影響，可見FDA對(duì)siRNA藥物免疫原性的關(guān)注。通過對(duì)臨床試驗(yàn)中ADA及藥代檢測(cè)方法的梳理，可更好地指導(dǎo)非臨床研究中生物分析工作的開展，并提高其臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值。與所有寡核苷酸類藥物一樣，Givosiran 給藥可能存在免疫原性，在上述臨床試驗(yàn)中，ADA作為探索性試驗(yàn)終點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)：通過經(jīng)驗(yàn)證的ELISA法，其血清中最低檢出濃度（靈敏度）為 37.4 ng/mL，最小要求稀釋倍數(shù)（MRD）為50倍。臨床結(jié)果顯示，Givosiran 經(jīng)皮下注射給藥后，ADA陽(yáng)性率較低，如 Ⅲ 期 DB 階段安慰劑組和Givosiran 組 ADA 陽(yáng)性率分別有 1/46和 2/48患者在基線時(shí)檢測(cè)到 ADA 陽(yáng)性（滴度≤100）；DB 和 OLE 階段，Givosiran 組有1/94患者產(chǎn)生新的 ADA，抗體滴度低且呈一過性，隨后檢測(cè)均為陰性。ADA 的發(fā)生對(duì) Givosiran 的 PK，PD 沒有影響；對(duì)Givosiran 及其代謝產(chǎn)物的濃度未見影響。以上結(jié)果提示，Givosiran具有非常低的引發(fā)免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)對(duì)藥代生物分析進(jìn)行梳理，通過經(jīng)驗(yàn)證的LC-MS/HRAM、LC-MS/MS法，其血漿中最低檢出濃度為 10、20 ng/mL，其尿液中最低檢出濃度為 50 ng/mL，評(píng)估 Givosiran 及其代謝產(chǎn)物的濃度。檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)與 ADA 檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)幾乎一致。
免疫原性檢測(cè)方法學(xué)和檢測(cè)結(jié)果
藥代動(dòng)力學(xué)檢測(cè)方法學(xué)主要參數(shù)
在非臨床藥效學(xué)研究中，對(duì)于Givosiran作用機(jī)制相關(guān)的藥效學(xué) Biomarker 的變化規(guī)律進(jìn)行了探索，這些研究不但支持了FIH起始劑量的設(shè)計(jì)，也為臨床試驗(yàn)中藥效動(dòng)力學(xué)檢測(cè)指標(biāo)和監(jiān)測(cè)時(shí)間的確立提供了依據(jù)。采用嚙齒類和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型進(jìn)行的AHP非臨床研究中：以0.3、1或3 mg/kg（QW*4）劑量大鼠AIP模型皮下給藥后，與單次給藥類似，對(duì) ALAS1 mRNA 的抑制具有劑量依賴性，同時(shí)伴隨著尿液中ALA和PBG水平的相應(yīng)下降；
以 2.5、5 mg/kg（QW*8）劑量食蟹猴皮下注射 Givosiran 后，血清中 ALAS1 mRNA 水平最大減少約 80%。這些試驗(yàn)不但考察了 Givosiran 用于AHP治療的作用機(jī)制，也為臨床試驗(yàn)中合理的可用于監(jiān)測(cè)和提示預(yù)期療效的Biomarker的確立提供了參考。
依賴于對(duì) Givosiran 作用機(jī)制的理解以及非臨床研究結(jié)果，在I期、I/II臨床OLE期和 III期臨床試驗(yàn)中均考察了給藥后ALAS1 mRNA、ALA及PBG水平等藥效學(xué)標(biāo)志物的變化，并將其作為劑量和給藥頻率選擇的依據(jù)。結(jié)果顯示， Givosiran 在 2.5 mg/kg劑量下，經(jīng)SC給藥能夠降低肝臟中ALAS1的水平，同時(shí)尿中 ALA 和 PBG 的水平也降低到了正常范圍。該結(jié)果與臨床前藥效學(xué)研究結(jié)果具有較好的相關(guān)性，從側(cè)面提示了非臨床藥效學(xué)研究對(duì)于提示臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)的重要性。非臨床研究與臨床試驗(yàn)PD marker相關(guān)性分析
肝臟毒性是非臨床和臨床對(duì)應(yīng)關(guān)聯(lián)的毒性表現(xiàn)，可在臨床階段進(jìn)行密切監(jiān)控，全面評(píng)估藥物的安全性和風(fēng)險(xiǎn)：非臨床結(jié)果顯示肝細(xì)胞單細(xì)胞壞死、肝細(xì)胞嗜堿性顆粒等；臨床中也有一定肝毒性結(jié)果。
對(duì)于寡核苷酸藥物，非臨床研究中發(fā)現(xiàn)的毒性與臨床試驗(yàn)中出現(xiàn)的 AE 具有較高的關(guān)聯(lián)性。Givosiran 非臨床結(jié)果顯示肝細(xì)胞單細(xì)胞壞死、肝細(xì)胞嗜堿性顆粒等，臨床中則可見轉(zhuǎn)氨酶升高和肝臟毒性，并在說明書中給予警示。上述關(guān)聯(lián)性提示，非臨床研究對(duì)于評(píng)估臨床安全性和指導(dǎo)風(fēng)險(xiǎn)控制計(jì)劃的制定具有重要價(jià)值。
綜上所述，非臨床研究為臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了依據(jù)；科學(xué)的劑量和給藥方案探索、無(wú)縫銜接的臨床研究規(guī)劃、合理的III期臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)是 Givosiran 快速獲得監(jiān)管機(jī)構(gòu)上市批準(zhǔn)的重要保障。此外，基于穩(wěn)健的前期數(shù)據(jù)，與監(jiān)管機(jī)構(gòu)進(jìn)行有效的溝通也是必不可少的藥政策略。Givosiran 的上市歷程和臨床開發(fā)路徑的復(fù)盤分析為 siRNA 藥物的研發(fā)提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)和啟示。
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