生物制品的質(zhì)量控制是其藥學(xué)研究和評(píng)價(jià)的關(guān)鍵，貫穿藥品的整個(gè)生命周期。隨著生物制品相關(guān)分析技術(shù)的發(fā)展和上市后產(chǎn)品知識(shí)的積累，上市許可持有人(marketing authorization holder，MAH)可持續(xù)改進(jìn)藥物分析方法，增強(qiáng)質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)管理。本文從監(jiān)管角度出發(fā)，探討關(guān)于治療用生物制品分析方法變更的審評(píng)考量，分享分析方法變更的相關(guān)案例，為制藥企業(yè)持續(xù)不斷提升藥物質(zhì)量控制和完善分析方法變更申報(bào)資料提供參考。
關(guān)鍵詞：治療用生物制品；分析方法；全生命周期管理；上市后藥學(xué)變更生物制品的質(zhì)量控制是其藥學(xué)研究和評(píng)價(jià)的關(guān)鍵內(nèi)容，貫穿藥物的全生命周期管理。在開發(fā)期間研究者需要根據(jù)臨床安全性、有效性、免疫原性和藥動(dòng)學(xué)影響對(duì)藥物質(zhì)量屬性進(jìn)行評(píng)估，以確定其是否為關(guān)鍵質(zhì)量屬性，針對(duì)關(guān)鍵質(zhì)量屬性建立相應(yīng)的控制策略，選擇特定檢測(cè)項(xiàng)目的分析方法,并對(duì)檢測(cè)結(jié)果制定合理的可接受范圍[1-2]。分析方法作為質(zhì)量控制的重要組成部分，決定了質(zhì)量控制體系的可靠性和準(zhǔn)確性。分析方法的開發(fā)、驗(yàn)證、轉(zhuǎn)移、變更和日常監(jiān)測(cè)是連續(xù)且相互關(guān)聯(lián)的，貫穿了產(chǎn)品生命周期管理的始終，不斷推動(dòng)著產(chǎn)品質(zhì)量朝著更優(yōu)的方向發(fā)展[3-4]。藥物早期的研發(fā)、臨床試驗(yàn)申請(qǐng)和注冊(cè)過程往往經(jīng)歷分析方法的開發(fā)、建立、確認(rèn)、驗(yàn)證、轉(zhuǎn)移、再驗(yàn)證等過程，從而確保分析方法適用于藥物的過程中控制、放行檢測(cè)和穩(wěn)定性檢測(cè)[5]。在獲批上市后,一方面上市許可持有人(marketing authorization holder,MAH)需要對(duì)生產(chǎn)工藝進(jìn)行持續(xù)驗(yàn)證，不斷積累商業(yè)化生產(chǎn)的研究數(shù)據(jù)；另一方面，隨著更加先進(jìn)和靈敏的分析技術(shù)的出現(xiàn)和成熟運(yùn)用，MAH 利用這些新技術(shù)持續(xù)改進(jìn)藥物分析方法，采用更優(yōu)的分析技術(shù)以增強(qiáng)產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)管理能力[6]。應(yīng)用新的質(zhì)量控制分析方法，往往具有降低檢驗(yàn)成本、提高方法穩(wěn)健性、加快產(chǎn)品放行、減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用等方面的優(yōu)勢(shì)。本文將從監(jiān)管角度出發(fā)，探討生物制品分析方法變更的相關(guān)案例，為MAH 持續(xù)不斷提升藥品質(zhì)量控制和完善上市后變更申報(bào)資料提供參考。ICH Q8，Q9，Q10 和 Q11 等指導(dǎo)原則描述了用于藥物開發(fā)的質(zhì)量源于設(shè)計(jì)(quality by design，QbD)理念、方法和工具以及全生命周期的質(zhì)量體系要求[6-8]。隨著 QbD 在藥物開發(fā)中的應(yīng)用越來越廣泛，已擴(kuò)展到包括分析方法生命周期在內(nèi)的分析方法開發(fā)和維護(hù)中。在分析質(zhì)量源于設(shè)計(jì)(analyti-cal quality by design，AQbD)框架下，MAH 應(yīng)充分利用專業(yè)知識(shí)和生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，積極運(yùn)用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)管理工具，開展持續(xù)的監(jiān)測(cè)和驗(yàn)證，從而獲得符合預(yù)期性能要求的質(zhì)量可靠的分析方法[9]?；诳茖W(xué)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和全面的變更研究是分析方法生命周期內(nèi)迭代更新的基礎(chǔ)。MAH 在進(jìn)行分析方法的迭代更新研究時(shí)，可以參考相關(guān)的國內(nèi)外技術(shù)指南，例如國家藥品監(jiān)督管理局的《已上市生物制品藥學(xué)變更研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》、ICH Q12 的“藥品生命周期管理的技術(shù)和監(jiān)管考慮”、ICH Q14 的“分析方法開發(fā)(草案)等[10-11]。生物制品分析方法的迭代變更與產(chǎn)品質(zhì)量控制密切相關(guān)，由 MAH 對(duì)分析方法的變更進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，確定風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)。MAH 可以參考《已上市生物制品藥學(xué)變更研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》，同時(shí)結(jié)合分析方法特點(diǎn)和實(shí)際變更內(nèi)容展開風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)執(zhí)行變更研究，按照藥品注冊(cè)管理的規(guī)定及程序申報(bào)補(bǔ)充申請(qǐng)、備案或報(bào)告。變更執(zhí)行后，MAH 仍需持續(xù)對(duì)分析方法的性能進(jìn)行監(jiān)測(cè)，收集產(chǎn)品質(zhì)量相關(guān)信息。分析方法變更研究流程示例見圖1。分析方法在產(chǎn)品生命周期內(nèi)的迭代更新應(yīng)朝著更加準(zhǔn)確、靈敏、穩(wěn)健、快捷的目標(biāo)努力，從而保證質(zhì)量控制體系的先進(jìn)性和可靠性。MAH應(yīng)在申報(bào)資料中提供變更分析方法的理由和依據(jù)。通常導(dǎo)致分析方法更新的理由可能包括企業(yè)自身因素和外部因素。企業(yè)因素包括提高方法性能、降低檢驗(yàn)成本、易于操作、加快產(chǎn)品放行、解決供應(yīng)鏈問題等，或由于對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量屬性有更深人全面的認(rèn)識(shí)而提出更多分析要求(如抗體中的痕量序列變異體[12]）。外部因素包括《中華人民共和國藥典》分析方法的升級(jí)或?yàn)榱朔稀吨腥A人民共和國藥典》各論要求、上市后批件遺留問題要求、生物類似藥對(duì)應(yīng)的參照藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或分析方法升級(jí)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理壓力等。1.2 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估
MAH 應(yīng)根據(jù)分析方法迭代更新的具體事項(xiàng)、可能后果和不確定性對(duì)預(yù)期變更進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，需要考慮的因素通常包括待檢測(cè)質(zhì)量屬性的等級(jí)、技術(shù)復(fù)雜性和變更程度等。不同質(zhì)量屬性對(duì)于產(chǎn)品質(zhì)量和療效的影響類型和影響程度需要結(jié)合潛在臨床影響(有效性、安全性、藥動(dòng)學(xué)和免疫原性)進(jìn)行進(jìn)一步風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。MAH 可以通過運(yùn)用不同的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具，根據(jù)產(chǎn)品特定的研究、同類產(chǎn)品/平臺(tái)經(jīng)驗(yàn)外部文獻(xiàn)知識(shí)確定質(zhì)量屬性等級(jí)。通常情況下，某一質(zhì)量屬性的等級(jí)越高，則用于控制該質(zhì)量屬性的分析方法變更的風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)越高。基于動(dòng)物、細(xì)胞和免疫化學(xué)的活性分析方法與理化分析方法相比,技術(shù)復(fù)雜性更高、潛在影響因素更多，因而變更風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)更高。重組蛋白類產(chǎn)品的電荷變異體通常色譜圖的組分峰復(fù)雜，某些峰間分離度較差，需要根據(jù)酸堿組分進(jìn)行合并報(bào)告，風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)較高。外觀(顏色、澄清度)和鑒別項(xiàng)目屬于定性的分析方法，如采用藥典方法或成熟的技術(shù)時(shí)，與其他用于質(zhì)量控制的定量分析方法相比技術(shù)復(fù)雜性較低。分析方法在整個(gè)生命周期內(nèi)均可能發(fā)生變更，變更可能為同一分析方法內(nèi)的參數(shù)微調(diào)和修改，或者完全替換成新的分析方法。耐用性研究中經(jīng)驗(yàn)證的參數(shù)變更時(shí)，或僅在相同分析方法內(nèi)進(jìn)行一個(gè)或者多個(gè)參數(shù)的微調(diào)時(shí)，風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)較低。藥典方法是經(jīng)過充分證明、技術(shù)成熟且廣泛應(yīng)用的分析方法，當(dāng)將藥典中同一檢項(xiàng)下的一個(gè)檢測(cè)方法變?yōu)榱硪粋€(gè)檢測(cè)方法，或者由企業(yè)內(nèi)部分析方法變?yōu)樗幍浞椒〞r(shí)，通常風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)較低，但仍需要進(jìn)行研究和評(píng)估。某一檢測(cè)方法從藥典方法變?yōu)榉撬幍浞椒〞r(shí)，需要謹(jǐn)慎并進(jìn)行全面合理的研究與評(píng)估。新技術(shù)更迭如果涉及分析方法原理變更，由于先驗(yàn)知識(shí)和使用經(jīng)驗(yàn)的缺乏，在應(yīng)用初期存在一些不確定性，風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)較高。MAH 在確定分析方法變更的風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)后，可參考相關(guān)法規(guī)和指導(dǎo)原則制定變更研究策略，開展相關(guān)研究。分析方法的迭代更新可以從以下方面開展研究：對(duì)新方法進(jìn)行全面的方法學(xué)驗(yàn)證；采用變更前后的分析方法對(duì)代表性樣品進(jìn)行比對(duì)分析，從而確定變更前后分析方法的等效性；根據(jù)等效性研究結(jié)果評(píng)估原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)項(xiàng)目的可接受范圍是否適用于更新的分析方法；如不再適用,需要重新擬定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的擬定可以參考相關(guān)文獻(xiàn)、ICH Q6B 和《中華人民共和國藥典》要求[1,6]。MAH 需要提供質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)擬定依據(jù)及擬定過程，證明質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定的合理性。ICH Q14“分析方法開發(fā)(草案)提出了一種分析方法變更評(píng)價(jià)的示例，見表1。▲表1-ICH Q14 分析方法變更評(píng)價(jià)示例生物制品具有復(fù)雜的高級(jí)結(jié)構(gòu)、翻譯后修飾和糖基化修飾，同時(shí)在貯存中容易發(fā)生聚集和降解，產(chǎn)生分子大小異構(gòu)體和電荷異構(gòu)體[13]。這些變體的存在可能對(duì)產(chǎn)品生物學(xué)活性、免疫原性及體內(nèi)代謝產(chǎn)生影響，通常需要采用多種分析手段對(duì)生物制品的純度進(jìn)行控制。隨著分析檢測(cè)技術(shù)手段的升級(jí)，越來越多重現(xiàn)性好、靈敏度高、自動(dòng)化程度高的分析方法用于替代傳統(tǒng)分析方法，應(yīng)用于藥物的質(zhì)量控制，例如采用毛細(xì)管凝膠電泳(capillary electrophore-sis-sodium dodecyl sulfate,CE-SDS)替代還原/非還原十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳( sodiumdodeeyl sulfate-polyacrylamide gel eleetrophoresis , SDS-PAGE)控制藥物的分子大小異構(gòu)體；采用成像毛細(xì)管等電聚焦(imaged capillary isoelectric focusing,iCIEF)毛細(xì)管等電聚焦電泳(capillary isoelectricfocusing，cIEF)替換定性的等電聚焦(isoelectric fo-cusing,EF)控制藥物的電荷異構(gòu)體[14-15]。
當(dāng)與純度相關(guān)的分析檢測(cè)技術(shù)手段發(fā)生升級(jí)時(shí)，通常需要對(duì)新方法進(jìn)行完整的方法學(xué)驗(yàn)證，同時(shí)對(duì)新舊方法的關(guān)鍵方法學(xué)性參數(shù)(如精密度、準(zhǔn)確度、檢測(cè)限)進(jìn)行比較,新方法的靈敏度應(yīng)不低于舊方法。在此案例中，某企業(yè)原本采用 IEF 凝膠分析聯(lián)用考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行原液和成品的放行與穩(wěn)定性檢測(cè)，以控制電荷異質(zhì)性,但該產(chǎn)品電荷異質(zhì)體組分復(fù)雜，不能準(zhǔn)確定量；擬采用較新的cEF平臺(tái)技術(shù)替代半定量IEF，以便更為準(zhǔn)確地定量測(cè)量電荷異構(gòu)體。研究者進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，包括專屬性準(zhǔn)確度、重復(fù)性、中間精密度、線性、范圍、定量限、檢測(cè)限、耐用性,并考察了方法的穩(wěn)定性指示作用。cIEF 峰檢測(cè)限為 0.3%，相比之下變更前 IEF 凝膠中條帶的檢測(cè)限為1%，擬定分析方法實(shí)現(xiàn)了定量檢測(cè)，靈敏度更高。研究者需要將現(xiàn)行方法與擬定方法比較，同步采用現(xiàn)行方法和擬定方法分析一定批次的代表性樣品，從而確定變更前后分析方法的等效性。純度和異構(gòu)體檢測(cè)項(xiàng)目通常具有穩(wěn)定性指示意義，研究者可采用新舊分析方法對(duì)穩(wěn)定性留樣或強(qiáng)制破壞樣品進(jìn)行同步分析。此外，由于擬定分析方法可能對(duì)產(chǎn)品異構(gòu)體的分離能力更好，研究者還應(yīng)對(duì)新分析方法檢測(cè)出的異構(gòu)體組分峰或新的雜質(zhì)峰進(jìn)行分離鑒定和表征研究[16-17]。在此案例中，研究者分離不同的電荷異構(gòu)體組分峰后，采用液質(zhì)聯(lián)用的方法表征蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)和糖類結(jié)構(gòu)，對(duì)富集的電荷異構(gòu)體進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征和生物學(xué)活性檢測(cè)，結(jié)果證明電荷異質(zhì)性與C末端賴氨酸含量變化、天冬酰胺脫酰胺化和唾液酸修飾有關(guān)。在此案例中，先前的原液和制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)限度范圍不再適用于新的分析方法，研究者可根據(jù)代表性原液和制劑的放行數(shù)據(jù)、長期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)和分析方法的變異性擬定變更后檢測(cè)方法的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。研究者采用了68個(gè)原液批次(包括凍存留樣和商業(yè)化批次)確立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，分別計(jì)算了歷史12個(gè)批次和當(dāng)前 48 個(gè)批次的主峰、酸性峰和堿峰的均值±3SD 區(qū)間，擬定了原液放行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍。申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)實(shí)際申報(bào)的具體情況(如質(zhì)量屬性特點(diǎn)、工藝能力、臨床試驗(yàn)相關(guān)性等)選擇合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。在制定成品的放行和貨架期標(biāo)準(zhǔn)時(shí)還需要考慮制劑生產(chǎn)和貯存過程中發(fā)生的電荷異構(gòu)體變化。審評(píng)機(jī)構(gòu)將根據(jù)變更風(fēng)險(xiǎn)要求申請(qǐng)人基于更新的檢定方法及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與中國食品藥品檢定研究院接洽單項(xiàng)復(fù)核檢定事宜。綜上，通過對(duì)代表性批次樣品的分析和全面的方法學(xué)驗(yàn)證，研究者證明新方法的靈敏度和分離度有顯著提高且具有穩(wěn)定性指示意義，并對(duì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)限度范圍的適用性進(jìn)行了重新評(píng)估，從而保證了質(zhì)量控制體系的先進(jìn)性和可靠性。2.2 工藝相關(guān)雜質(zhì)分析方法
生物制品的工藝相關(guān)雜質(zhì)通常來源于細(xì)胞基質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)或下游工藝，包括宿主細(xì)胞蛋白( hostcell protein，HCP)、宿主細(xì)胞殘留 DNA、細(xì)菌內(nèi)毒素、色譜配基、工藝添加物等。工藝相關(guān)雜質(zhì)應(yīng)盡可能在下游純化工藝中去除，以保障患者安全。風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)較高的工藝相關(guān)雜質(zhì)通常作為常規(guī)監(jiān)測(cè)納入原液放行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。殘留 HCP 具有潛在的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，還可導(dǎo)致蛋白聚集、降低最終產(chǎn)品的質(zhì)量，影響制劑和處方的穩(wěn)定性[18]。作為工藝相關(guān)雜質(zhì)的控制重點(diǎn)，下文將對(duì) HCP 殘留量分析方法的變更研究進(jìn)行探討。生物制品的 HCP 殘留量通常采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)進(jìn)行定量檢測(cè)。ELISA 包被板中的多克隆抗HCP抗體決定了測(cè)定法的靈敏度和 HCP 覆蓋率。在產(chǎn)品開發(fā)初期，研究者通常采用商業(yè)化試劑盒進(jìn)行HCP 殘留量的檢測(cè)。進(jìn)入關(guān)鍵性臨床階段以后，研究者將自行開發(fā)基于專屬產(chǎn)品和特定工藝的ELISA分析方法。研究者可采用基于凝膠的分析方法(如2D-PAGE/2D-Western blot)或液質(zhì)聯(lián)用( liquid chro-matography-mass spectrometry,LC-MS)分析方法完成新舊方法 HCP 覆蓋率的檢測(cè)。關(guān)于擬定方法應(yīng)達(dá)到的最小 HCP 覆蓋率，目前監(jiān)管機(jī)構(gòu)尚未有明確共識(shí)，但新分析方法的 HCP 覆蓋率理論上不應(yīng)低于原分析方法。例如，某企業(yè)申請(qǐng)采用新開發(fā)的多克隆抗CHOHCP 家免抗體代替原有的山羊抗體進(jìn)行EISA 分析，從而實(shí)現(xiàn)更好的免疫應(yīng)答。變更試劑盒抗體來源后，試劑盒對(duì)較低分子量和堿性殘留蛋白的檢出效率更高，采用 CHO HCP 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)比研究，原抗體檢測(cè)覆蓋率約68%，擬定方法抗體檢測(cè)蓋率約95%。申報(bào)資料對(duì)95個(gè)歷史批次分別采用變更前后的檢定方法檢定 HCP，結(jié)果顯示相同批次產(chǎn)品的 HCP 水平整體升高，超出原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)限度和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)限度。本品僅進(jìn)行了 HCP 試劑盒更新，生產(chǎn)工藝等其他方面均未發(fā)生變更，產(chǎn)品質(zhì)量無實(shí)質(zhì)變化，更新的檢測(cè)試劑盒 HCP 覆蓋率提高，申請(qǐng)人自檢結(jié)果與中國食品藥品檢定研究院檢定結(jié)果差異較小，基于充分的變更研究和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，認(rèn)為修訂該技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)具有較好的科學(xué)基礎(chǔ)。需要關(guān)注的是，在分析方法變更的同時(shí)如伴隨其他變更，不能判斷產(chǎn)品質(zhì)量是否發(fā)生變化時(shí)，放寬 HCP 雜質(zhì)殘留限度有可能增加患者的安全性風(fēng)險(xiǎn)，研究者需要結(jié)合人體暴露量、臨床免疫原性和安全性數(shù)據(jù)、殘留 HCP 的種類和風(fēng)險(xiǎn)等充分評(píng)估放寬 HCP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)限度的合理性。當(dāng)前生物制品殘留 HCP含量的控制依然基于可檢測(cè)的宿主殘留蛋白總量?？紤]到不同產(chǎn)品的純化工藝對(duì) HCP 的清除能力不同，且各種 HCP 的分子大小、結(jié)構(gòu)、可檢測(cè)性和安全性風(fēng)險(xiǎn)存在差異如何使新型 HCP 分析方法和控制手段應(yīng)用于產(chǎn)品質(zhì)量控制，實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的基于風(fēng)險(xiǎn)的控制，有待監(jiān)管機(jī)構(gòu)和工業(yè)界共同探討。近年來，基于LC/MS 的HCP 檢測(cè)方法在鑒別和定量的性能上逐漸超越了常規(guī)免疫測(cè)定法。LC/MS分析方法可實(shí)現(xiàn)不同HCP的分離鑒定和分別定量，從而更好地針對(duì)其安全性風(fēng)險(xiǎn)實(shí)施控制，在考察下游純化工藝對(duì) HCP 的清除研究以及 HCP 覆蓋率研究中都具有巨大的應(yīng)用潛力[19-22] 。當(dāng) ELISA 方法檢測(cè)到總 HCP 水平升高或其他異常的分析檢測(cè)情況時(shí)，可采用替代方法對(duì)個(gè)別潛在高風(fēng)險(xiǎn) HCP 進(jìn)行針對(duì)性的監(jiān)測(cè)。例如，某些特定 HCP 具有降解制劑中關(guān)鍵輔料聚山梨酯80的酶活性,從而影響制劑穩(wěn)定性；可以開發(fā)基于酶活性的檢測(cè)方法對(duì)特定 HCP 進(jìn)行監(jiān)測(cè)和控制。此外，研發(fā)機(jī)構(gòu)在必要時(shí)可采用分離的高風(fēng)險(xiǎn)雜質(zhì)開展進(jìn)一步的免疫原性評(píng)估和毒理學(xué)研究，甚至從工程細(xì)胞構(gòu)建的源頭敲除高風(fēng)險(xiǎn) HCP 相關(guān)基因。生物學(xué)活性是產(chǎn)品有效性的評(píng)估手段，是產(chǎn)品最關(guān)鍵的質(zhì)量屬性之一。生物制品的生物學(xué)活性測(cè)定應(yīng)盡可能反映產(chǎn)品的作用機(jī)制。生物學(xué)活性的分析方法可用于定性鑒別，也可用于定量檢測(cè)。結(jié)合不同制品的作用機(jī)制差異，研發(fā)機(jī)構(gòu)可開發(fā)體內(nèi)動(dòng)物分析、細(xì)胞活性、結(jié)合活性等多種活性檢測(cè)手段，目前胰島素類產(chǎn)品已經(jīng)可以用色譜法替代動(dòng)物法但是一些激素類產(chǎn)品(如生長激素、促卵泡激素等)被《中華人民共和國藥典》收錄的生物學(xué)活性仍均基于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如小鼠、大鼠或家免等[23]。從體內(nèi)生物測(cè)定法變更到體外生物測(cè)定法或理化分析法可減少使用實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物，符合國際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3R 原則即reduction(減少)、replacement(替代)、refinement(優(yōu)化)[24-25]。研究者應(yīng)說明用體外活性方法替代動(dòng)物法的科學(xué)性和合理性，充分證明2種方法的相關(guān)性及體外活性測(cè)定方法的可行性。在具有充分依據(jù)的情況下，研究者可以申請(qǐng)用細(xì)胞活性分析方法替代基于動(dòng)物的分析方法。替代性的體外活性測(cè)定可以根據(jù)不同產(chǎn)品的作用機(jī)制開發(fā)，例如通過測(cè)試目的蛋白與膜受體結(jié)合的效率，或者通過測(cè)量目的蛋白刺激培養(yǎng)目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)酶或輔助信使的能力來實(shí)現(xiàn)。報(bào)告基因法是待測(cè)生物制品的刺激反應(yīng)元件或作用靶標(biāo)和熒光素酶基因共同轉(zhuǎn)染生物學(xué)活性測(cè)定細(xì)胞，當(dāng)樣品與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活反應(yīng)原件，導(dǎo)致熒光素酶的表達(dá)激活或抑制，從而在體外可使用光度計(jì)進(jìn)行定量檢測(cè)。某企業(yè)申請(qǐng)用葡萄糖-6-磷酸酶熒光素酶啟動(dòng)子系統(tǒng)代替家免實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胰島素的生物學(xué)活性。研究者評(píng)估了方法的線性、重復(fù)性、中間精密度、準(zhǔn)確度、范圍、樣品/標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性和專屬性,結(jié)果滿足驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。如果測(cè)得的胰島素活性為不低于 15 U·mg-1，則認(rèn)為按照美國藥典(USPharmacopeia,USP)生物鑒別方法進(jìn)行的檢測(cè)符合要求。細(xì)胞受體檢測(cè)方法通過與公司參考標(biāo)準(zhǔn)品比較測(cè)定了某個(gè)樣品的相對(duì)效價(jià)百分比。研究者進(jìn)行了方法學(xué)比對(duì)研究，結(jié)果表明在家免實(shí)驗(yàn)中生物鑒別呈陽性的9個(gè)批次(2個(gè)原料藥生產(chǎn)廠生產(chǎn)的批次)在細(xì)胞受體檢測(cè)中也呈陽性。監(jiān)管方認(rèn)為變更前后方法學(xué)比對(duì)研究的批次和數(shù)據(jù)有限，建議在初期采用2種分析方法并行進(jìn)行原料藥的生物活性分析，積累足夠的放行檢測(cè)數(shù)據(jù)并充分評(píng)估2種分析方法的相關(guān)性。此外，研究者需要關(guān)注變更后原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是否依然適用。體內(nèi)法通常為定性檢測(cè)，而細(xì)胞分析方法作為可量化的指標(biāo)，其標(biāo)準(zhǔn)限度應(yīng)設(shè)定上限和下限。
無菌檢測(cè)是生物制品放行檢測(cè)中的常規(guī)安全性檢測(cè)項(xiàng)目，通常根據(jù)《中華人民共和國藥典》2020 年版通則 1101 無菌檢查法檢測(cè),以確保產(chǎn)品無微生物污染。傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法需要14d的培養(yǎng)時(shí)間，由分析人員目視檢查。對(duì)于細(xì)胞治療等短效期的產(chǎn)品和用于流行病防控的新型疫苗產(chǎn)品，長達(dá)2周的微生物檢測(cè)時(shí)間可能成為制約產(chǎn)品放行和用于患者的限制因素。制藥行業(yè)在過去多年間，不斷致力于開發(fā)新型可替代的快速微生物檢驗(yàn)技術(shù)。采用快速微生物檢測(cè)技術(shù)替代傳統(tǒng)微生物檢測(cè)手段具有眾多優(yōu)勢(shì)：可加快產(chǎn)品放行、降低生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)控、保證數(shù)據(jù)完整性，同時(shí)對(duì)生產(chǎn)中的潛在污染更快響應(yīng)。目前應(yīng)用較廣泛的快速微生物檢測(cè)技術(shù)主要基于培養(yǎng)微生物獲取信號(hào)、直接測(cè)量微生物或分析細(xì)胞成分原理。常見的快速無菌檢測(cè)系統(tǒng)有 MilliflexCelsis Advanc,BacT/Alert,Bactec 等。Celsis 檢測(cè)系統(tǒng)和 Milliflex 檢測(cè)系統(tǒng)均基于 ATP 生物發(fā)光成像系統(tǒng)，BacT/Alert 檢測(cè)系統(tǒng)和 Bactec 檢測(cè)系統(tǒng)基于對(duì)代謝產(chǎn)物CO,的檢測(cè)。不同快速微生物檢測(cè)系統(tǒng)的分析檢測(cè)時(shí)間、測(cè)試能力、檢測(cè)限存在差異[26-28]。《中華人民共和國藥典》、美國藥典和歐洲藥典均收錄了微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證的相關(guān)指導(dǎo)原則，研究者可以根據(jù)微生物檢驗(yàn)方法的定性或定量差異，開展替代方法的方法學(xué)驗(yàn)證。微生物檢驗(yàn)替代方法的驗(yàn)證可參考《中華人民共和國藥典》2020年版三部“藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”開展。無菌檢查法的替代驗(yàn)證屬于定性檢查應(yīng)至少考察快速檢驗(yàn)分析方法的專屬性、檢測(cè)限、重現(xiàn)性和耐用性。微生物限度檢驗(yàn)的替代驗(yàn)證屬于定量檢查，應(yīng)考察快速檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度、精密度、專屬性、定量限、線性、范圍、重現(xiàn)性、耐用性。研究者還需要開展方法適用性研究，考察制劑是否存在生長抑制或產(chǎn)品干擾。研究者應(yīng)證明替代方法與藥典分析方法之間的等效性。等效性研究是一種比較試驗(yàn)，要求使用相同范圍的微生物平行運(yùn)行2 種方法。根據(jù)2種方法所產(chǎn)生數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理來證明替代方法結(jié)果等效或優(yōu)于(不劣于)藥典方法。如果替代方法產(chǎn)生的結(jié)果優(yōu)于或等效藥典方法，則認(rèn)為替代無菌檢查的性能等效?？焖贌o菌檢驗(yàn)替代方法的驗(yàn)證總結(jié)示例見表2。▲表2-快速無菌檢驗(yàn)替代方法的驗(yàn)證總結(jié)示例
微生物檢驗(yàn)替代方法的方法學(xué)驗(yàn)證和等效性研究所涉及菌株至少應(yīng)包含微生物限度檢查和無菌檢查法規(guī)定的藥典菌株，還應(yīng)根據(jù)替代方法及樣品特點(diǎn)增加相應(yīng)的菌株。《中華人民共和國藥典》中無菌檢查法的實(shí)驗(yàn)菌株包括金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白念珠菌、黑曲霉；非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查(微生物計(jì)數(shù)法)的實(shí)驗(yàn)菌株包括金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌、黑曲霉。此外，研究者可根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)增加一些環(huán)境常見菌、生長緩慢并難以檢測(cè)的菌株、對(duì)患者高風(fēng)險(xiǎn)的菌株和挑戰(zhàn)微生物(如饑餓或應(yīng)激菌株)。研究者應(yīng)在申報(bào)資料中充分評(píng)估微生物種類和選擇的合理性，例如，某公司在申請(qǐng)同步采用藥典方法和替代方法用于產(chǎn)品放行的變更時(shí)，未納人2種《中華人民共和國藥典》2020 年版要求的實(shí)驗(yàn)菌株，審評(píng)機(jī)構(gòu)建議其進(jìn)行相關(guān)補(bǔ)充研究或就未納人相關(guān)實(shí)驗(yàn)菌株的合理性予以解釋。考慮到傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法已應(yīng)用多年，監(jiān)管方可能建議在應(yīng)用替代分析方法的初期，同步采用藥典分析方法和替代分析方法進(jìn)行放行檢測(cè)，從而積累足夠批次的數(shù)據(jù)作為支持。當(dāng)然，快速替代微生物檢測(cè)方法也存在一些缺點(diǎn)，例如資金投入高單一供應(yīng)商、難以檢測(cè)生長緩慢的菌株或某些特定菌株等。為充分保障用藥者的安全,建議申請(qǐng)人根據(jù)替代方法的局限性制訂風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)對(duì)措施和質(zhì)量控制策略。分析方法的生命周期管理將在執(zhí)行變更后持續(xù)進(jìn)行[29]。研究者需要在日常運(yùn)行中對(duì)更新的方法進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)和定期評(píng)估，從而確認(rèn)分析方法的性能符合預(yù)期，促進(jìn)分析方法的持續(xù)改進(jìn)[30]。持續(xù)性監(jiān)測(cè)、工藝驗(yàn)證并積累商業(yè)化數(shù)據(jù)后，研究者還應(yīng)對(duì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可接受范圍的合理性進(jìn)一步評(píng)估[31]。分析方法在產(chǎn)品生命周期內(nèi)的迭代更新應(yīng)保證質(zhì)量控制體系的先進(jìn)性和可靠性[7]。MAH 應(yīng)基于科學(xué)和風(fēng)險(xiǎn)的基礎(chǔ)開展支持性研究，用充分的數(shù)據(jù)和邏輯支持變更。在分析方法發(fā)生變更的同時(shí)，如果生產(chǎn)物料和生產(chǎn)工藝沒有發(fā)生變化，那么產(chǎn)品質(zhì)量、安全性和有效性并不會(huì)發(fā)生實(shí)質(zhì)性變化，更新后的分析方法將更有利于反映產(chǎn)品質(zhì)量的真實(shí)狀況，降低檢測(cè)能力限制帶來的不確定性，識(shí)別質(zhì)量屬性出現(xiàn)異常的情況。平臺(tái)分析方法的上市后變更面臨著多個(gè)產(chǎn)品的同步實(shí)施。通常情況下,當(dāng)待測(cè)樣品的結(jié)構(gòu)和屬性相近的情況下，用于檢測(cè)不同產(chǎn)品的平臺(tái)方法的操作條件、系統(tǒng)適用性和報(bào)告方式不會(huì)發(fā)生顯著變化。當(dāng)執(zhí)行變更的風(fēng)險(xiǎn)對(duì)于類似多個(gè)產(chǎn)品相同或相似時(shí)，MAH應(yīng)根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行備案或申報(bào)，同類品種已獲準(zhǔn)的變更信息可作為平臺(tái)分析方法的支持性數(shù)據(jù)，同時(shí)還應(yīng)開展產(chǎn)品針對(duì)性的分析方法研究。對(duì)于在多個(gè)國家獲批上市的產(chǎn)品，往往面臨著全球監(jiān)管策略的差異和復(fù)雜性，MAH 在執(zhí)行變更時(shí)需要充分了解各個(gè)國家/地區(qū)監(jiān)管要求的差異，合理布局和規(guī)劃在各個(gè)批準(zhǔn)國家/地區(qū)的申報(bào)策略。聲明:本文系藥方舟轉(zhuǎn)載內(nèi)容，版權(quán)歸原作者所有，轉(zhuǎn)載目的在于傳遞更多信息，并不代表本平臺(tái)觀點(diǎn)。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)和其它問題，請(qǐng)與本網(wǎng)站留言聯(lián)系，我們將在第一時(shí)間刪除內(nèi)容
