強制降解試驗屬于藥物穩(wěn)定性研究內(nèi)容之一，也是藥物開發(fā)研究的一部分，有助于揭示藥物的穩(wěn)定特性和可能降解途徑，對于分析方法的開發(fā)和驗證也具有重要意義。
穩(wěn)定性研究通過設(shè)計一系列的試驗來揭示原料藥和制劑的穩(wěn)定性特征，是原料藥或制劑質(zhì)量控制研究的重要組成部分，始于藥品研發(fā)的初期，并貫穿于藥品研發(fā)的整個過程。
強制降解試驗（stresstesting）屬于穩(wěn)定性研究內(nèi)容之一，ICH Q1A指導(dǎo)原則對其定義分為原料藥和制劑2個部分：強制降解試驗（原料藥）即是為了揭示原料藥內(nèi)在穩(wěn)定性而進(jìn)行的研究，它是開發(fā)研究的一部分，這些試驗通常是在比加速試驗更劇烈的條件下進(jìn)行；強制降解試驗（制劑）即是為了評估劇烈條件對制劑的影響而進(jìn)行的研究，包括光穩(wěn)定性研究（見ICHQ1B）和對特定制劑（如定量吸入劑、乳膏、乳劑和需冷藏的水性液體制劑）的特殊試驗。綜合以上定義，強制降解試驗是指將原料藥或制劑置于比較劇烈的試驗條件下，考察其穩(wěn)定性的一系列試驗。查閱國內(nèi)外相關(guān)的指導(dǎo)原則，除光降解試驗的條件設(shè)置在ICH Q1B 中有較明確規(guī)定外，其他高溫、高濕、酸/堿水解及氧化破壞的具體試驗條件并未有明確規(guī)定。在技術(shù)審評中發(fā)現(xiàn)強制降解試驗的開展常存在試驗?zāi)康牟幻鞔_、試驗條件設(shè)計不合理、試驗結(jié)果評價分析不充分等問題。本文在參考相關(guān)文獻(xiàn)資料的基礎(chǔ)上，結(jié)合審評和研發(fā)工作中的理解和認(rèn)識，對合理設(shè)計和開展強制降解試驗研究進(jìn)行探討。開展強制降解試驗是獲得藥物可能的降解途徑和降解產(chǎn)物信息的重要途徑，有助于更全面了解產(chǎn)品的雜質(zhì)譜。對于分析方法的開發(fā)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立具有重要意義，是雜質(zhì)檢測方法建立、優(yōu)化和驗證的重要研究手段?？蔀樗幤返奶幏健⒐に嚒b、貯藏條件的確定提供有益支持。然而，由于藥品的結(jié)構(gòu)特性、劑型、工藝條件等各不相同，強制降解產(chǎn)生的雜質(zhì)難于預(yù)測，對分析檢測技術(shù)要求高，常給試驗的設(shè)計和開展帶來挑戰(zhàn)。常見問題主要表現(xiàn)在未結(jié)合藥物結(jié)構(gòu)和制劑特點等進(jìn)行合理設(shè)計，僅套用固定經(jīng)驗?zāi)Ｊ皆O(shè)置條件，達(dá)不到預(yù)期考察目的。如未針對藥品特點進(jìn)行分析和預(yù)試驗，采用過于劇烈的破壞條件得到降解產(chǎn)物甚至次級降解產(chǎn)物，而這些降解產(chǎn)物存在于加速和長期試驗樣品中的可能性很小，這對于了解藥物實際穩(wěn)定特性以及驗證分析方法的檢出能力的意義不大。檢測方法不適用也是常見問題，表現(xiàn)有未能建立合適的檢測方法檢出所有的降解產(chǎn)物，使主成分降解后測定的回收量偏低（質(zhì)量不平衡），如降解為小分子物質(zhì)（如無紫外吸收的降解產(chǎn)物）或形成聚合物，現(xiàn)有檢測方法可能無法檢出，或無法判斷色譜主峰中是否包含降解產(chǎn)物峰，或存在溶劑峰、輔料降解等因素造成的干擾。另外，在完成強制降解試驗后，對試驗結(jié)果評價分析不全面，未能充分理解試驗結(jié)果對分析方法優(yōu)化、處方工藝改進(jìn)、包材選擇等方面的指示作用，并且未能采取相應(yīng)風(fēng)險管理措施，也是常出現(xiàn)的問題。綜上所述，試驗條件設(shè)置不合理、檢測方法不適用以及對試驗結(jié)果缺乏理解分析，都會造成強制降解試驗流于形式，達(dá)不到應(yīng)有的研究目的。因此，強制降解試驗需要合理的設(shè)計和開展，并對試驗結(jié)果進(jìn)行充分分析和理解。一般5%~20% 的降解較為合適，需避免二次降解。對于難以降解的、非常穩(wěn)定的化合物，應(yīng)提供合理解釋和判斷依據(jù)。
《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中也指出，破壞試驗的程度暫無統(tǒng)一要求，一般以強力破壞后主成分的含量仍占絕大部分為宜。此時已產(chǎn)生了一定量的降解產(chǎn)物，與樣品長期放置的降解情況相似，考察此情況下的分離度更具有實際意義。要達(dá)到這種破壞程度，需要在研究過程中進(jìn)行摸索，先通過文獻(xiàn)調(diào)研、理論分析或預(yù)試驗了解樣品對光、熱、濕、酸、堿、氧化條件的基本穩(wěn)定情況，然后優(yōu)化確定破壞性試驗條件（如光照強度、酸堿濃度、破壞的時間、溫度等），以得到能充分反映降解產(chǎn)物與主成分分離的結(jié)果和圖譜。檢測方法對降解產(chǎn)物的檢出能力和測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，對于開展有意義的強制降解試驗十分重要，不同的檢測方法可能獲得不同的檢測結(jié)果。降解產(chǎn)物通常采用色譜法測定，但由于具體藥物的特點各異，必要時可能需要結(jié)合藥物和降解產(chǎn)物的理化性質(zhì)選擇不同的色譜方法（如HPLC，GC，TLC 等）或檢測器（如二極管陣列檢測器、質(zhì)譜檢測器等），有時可組合采用不同分離機制的色譜系統(tǒng)。而另一方面，強制降解試驗對于檢測方法的優(yōu)化、建立和驗證具有重要意義。在強制降解試驗條件下產(chǎn)生的降解產(chǎn)物較藥品貨架期產(chǎn)生的降解產(chǎn)物復(fù)雜、未知雜質(zhì)多，分離難度大，因此強制降解試驗對于驗證檢測方法的專屬性具有重要的提示作用。需注意對降解前后質(zhì)量平衡情況的考察，比較破壞前后檢出的雜質(zhì)個數(shù)和含量，回收率偏低時考慮是否有降解產(chǎn)物未檢出，可能要進(jìn)一步進(jìn)行色譜峰純度考察。因此，開展有意義強制降解試驗需要有指示性的檢測方法，而具有指示性的檢測方法的開發(fā)和建立又是基于良好設(shè)計、有意義的強制降解試驗開展之上的。對于創(chuàng)新藥，由于對其各方面的性質(zhì)的了解是隨研發(fā)進(jìn)展不斷深入的。因此，通過設(shè)計比較完整的強制降解試驗，有利于比較全面地了解其穩(wěn)定特性，從而為制劑處方、工藝的設(shè)計，以及產(chǎn)品儲存條件的確定等提供有益的參考。對于這類藥品，強制降解試驗開展得越早越好，如在產(chǎn)品開發(fā)、分析方法建立階段就可以同步進(jìn)行，不要等到在長期穩(wěn)定性放樣，甚至臨床使用中才暴露出問題。考察條件的設(shè)置也應(yīng)盡可能全面，如盡量涵蓋光照、高溫、酸/堿水解及氧化等各種降解類型，各種降解類型考察中也可設(shè)置多種破壞強度，受試樣品可分別在固體和溶液狀態(tài)下進(jìn)行考察。對于仿制藥，一般可通過文獻(xiàn)調(diào)研了解參比制劑或同類藥品的穩(wěn)定特性及其降解途徑，并結(jié)合藥物結(jié)構(gòu)和劑型特點等先驗知識，有側(cè)重地考察已有較明確提示信息的特定降解類型，如多肽藥物對光和熱敏感，或藥品結(jié)構(gòu)中含有易水解基團。另外，當(dāng)仿制藥處方工藝或有關(guān)物質(zhì)分析方法與參比差異較大時，特別是未對各有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行全面定性研究或無相應(yīng)雜質(zhì)對照品對有關(guān)物質(zhì)分析方法進(jìn)行驗證時，強制降解試驗常作為驗證檢測方法專屬性和靈敏度的重要手段。如可采用破壞性試驗得到含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣，用建立有關(guān)物質(zhì)分析方法與另一個經(jīng)驗證的，或藥典方法進(jìn)行含量測定，比較測定結(jié)果穩(wěn)定性研究應(yīng)檢驗?zāi)切┰谫A藏期間易變化的、可能影響質(zhì)量、安全性和/或有效性的項目；檢驗應(yīng)包括適當(dāng)?shù)奈锢?、化學(xué)、生物、微生物學(xué)特性，以及穩(wěn)定劑含量（如抗氧劑、抑菌劑）和功能性測試（如定量給藥系統(tǒng)）。強制降解試驗結(jié)束，應(yīng)立即檢查樣品物理性質(zhì)（如外觀、溶液的澄清度或顏色）的所有變化，并進(jìn)行含量和降解產(chǎn)物的測定。必要時還可根據(jù)品種的具體情況，針對可能影響藥品安全性和/或有效性的相關(guān)質(zhì)量屬性設(shè)置考察項目。一般來說，強制降解試驗只需選擇一批樣品進(jìn)行，如果需進(jìn)一步確認(rèn)藥品穩(wěn)定特性，可增加樣品批次進(jìn)行考察。強制降解試驗應(yīng)根據(jù)特定藥物的結(jié)構(gòu)特點、理化特性、劑型、工藝、包裝、儲藏、臨床使用情況等，有針對性地設(shè)置對產(chǎn)品開發(fā)、生產(chǎn)、使用、上市后變更等具有實際指示性的考察條件。而由于藥品特點各異以及開展試驗?zāi)康牟煌?，很難明確普遍適用的考察條件，筆者在調(diào)研相關(guān)指導(dǎo)原則和文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，對各降解類型試驗條件設(shè)置的考慮進(jìn)行介紹和探討。水解反應(yīng)是物質(zhì)與水發(fā)生的導(dǎo)致物質(zhì)發(fā)生分解的反應(yīng)，即物質(zhì)與水中的氫離子或者氫氧根離子發(fā)生反應(yīng)。大多數(shù)有機化合物的水解，僅用水是很難順利進(jìn)行的，一般需在堿性或酸性條件下進(jìn)行，這是由于水解反應(yīng)的發(fā)生需克服水解基團的水解活化能（activation energy，Ea），即需要考慮水解基團所處的電子和空間位阻效應(yīng)。如藥物分子中含有的羧酸酯、羧酸酰胺及磷酸酰胺等基團通常水解活化能較低（Ea 通常＜ 20 kcal·mol-1 ），是比較容易水解的位點；如醚及磺酰胺基團，一般水解活化能較高（Ea 通常＞ 30 kcal·mol-1 ），通常不易發(fā)生水解。酸/堿水解考察條件的設(shè)置主要考慮因素包括：酸/堿溶液的濃度（或pH 值）、考察的溫度與時間，具體考察條件需根據(jù)藥品特點，特別是分析藥物結(jié)構(gòu)中含有的水解基團及其所處的電子和空間位阻環(huán)境。如對于含有羧酸酯的藥物，其可能對堿水解十分敏感，就可使用較低濃度的氫氧化鈉溶液，在室溫條件下進(jìn)行考察即可。而同樣對于含有羧酸酯的藥物，如果所處空間環(huán)境位阻較大，如叔丁基酯，可能水解條件需適當(dāng)加強。另外，一些在水溶液中溶解度不好的親脂性藥物，需注意添加適當(dāng)?shù)挠袡C溶劑進(jìn)行增溶，不應(yīng)一味地增大破壞強度，造成次級降解。常用水解考察條件包括: 0.1~1 mol·L-1 的鹽酸或氫氧化鈉溶液，在室溫或加熱條件下進(jìn)行考察，如60 ℃ /2 d。光照強制降解試驗的條件設(shè)置在ICH Q1B 中有較明確規(guī)定，可分別在樣品均質(zhì)化或溶液狀態(tài)下進(jìn)行考察，一般要求總照度不低于1. 2 × 10^6 Lux·h（冷白光燈）或近紫外能量不低于200 w·h·m-2（紫外燈），如254 或365 nm 光源照射24 h。需注意將光照發(fā)熱對受試樣品的影響降到最低，還應(yīng)考慮樣品的物理性質(zhì)，并應(yīng)采取措施如冷藏和/或置密閉容器中，以確保物理狀態(tài)變化（如升華、蒸發(fā)、熔化）所造成的影響最小。對于熱降解，一般遵循阿倫尼烏斯（Arrhenius）方程，即隨溫度升高降解速率加快。高溫降解試驗即運用這一原理，通過設(shè)置較高的考察溫度在較短的時間內(nèi)獲得藥品的降解信息。具體考察溫度和時間需根據(jù)藥品特點，在前期預(yù)試驗的基礎(chǔ)上靈活確定，常見如80 ℃ /10 d，130 ℃ /8 h。也常結(jié)合濕度進(jìn)行設(shè)置，如對于原料藥或固體制劑通常采用相對濕度75% 或更高（如80 ℃ /92.5% RH等），而對于液體或半固體制劑可能需考慮采用干熱條件（低濕度），如相對濕度25%或更低。受試樣品可分別在固體和溶液狀態(tài)下進(jìn)行考察，需注意涵蓋生產(chǎn)過程中最差條件的考察，如含主藥的料液在噴霧干燥過程中溫度升高，又如半固體制劑水相或油相溶解主藥過程中可能需升高溫度。對于破壞程度過高或過低的情況，可能還需進(jìn)一步結(jié)合更接近于實際高溫情況的影響因素試驗（如60 ℃ /75%RH/1 個月）的考察結(jié)果，來綜合判斷是否藥物本身對熱特別穩(wěn)定或特別敏感。氧化是物質(zhì)失去電子的過程，有機化學(xué)中常把脫氫稱為氧化。氧化作為藥物降解的常見形式，主要有親核氧化和自由基介導(dǎo)的氧化2 種途徑。親核氧化主要采用雙氧水來加速模擬親核氧化反應(yīng)的發(fā)生，通常形成環(huán)氧化物、氮氧化物、砜及亞砜等降解產(chǎn)物。自由基介導(dǎo)的氧化，機制為自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，前期鏈啟動過程緩慢，特別是自發(fā)氧化，需要較長時間的介導(dǎo)過程；而一旦鏈?zhǔn)椒磻?yīng)啟動后，降解速度會逐漸加快，因此一般不遵循Arrhenius方程，即與時間不呈線性關(guān)系，可能表現(xiàn)在穩(wěn)定性試驗后期無規(guī)律地出現(xiàn)降解產(chǎn)物。加速模擬自由基介導(dǎo)的氧化通常需要光、熱、金屬離子或引發(fā)劑［如偶氮二異丁腈（AIBN）、過氧化二苯甲酰（BPO）等］觸發(fā)，常見的反應(yīng)位點在共軛碳碳雙鍵的α 位、芐基位、羰基α 位等。如生產(chǎn)管路的硅膠管成分復(fù)雜，含有的增塑劑（如BPO）可能作為引發(fā)劑觸發(fā)自由基氧化反應(yīng)。在自由基介導(dǎo)的氧化反應(yīng)中，有一類被稱為尤頓佛蘭德（Udenfriend）反應(yīng)，反應(yīng)機制為:① 絡(luò)合［金屬絡(luò)合劑如依地酸二鈉（EDTA）、檸檬酸等］的還原性金屬離子（如Fe2+，Cu1+等）介導(dǎo)氧氣產(chǎn)生自由基。② 自由基形成后，通過奪取底物的電子進(jìn)行傳遞，實現(xiàn)對底物的氧化。③ 抗氧劑（如抗壞血酸、苯酚類）或光照將被氧化的高價態(tài)金屬離子（如Fe3+，Cu2+等）又還原為低價態(tài)，繼續(xù)介導(dǎo)自由基的產(chǎn)生（見圖1）。即還原性金屬離子與金屬絡(luò)合劑絡(luò)合后，在抗氧劑存在或光照條件下，反而會加速觸發(fā)自由基的形成，導(dǎo)致氧化降解的發(fā)生。而針對這類氧化降解途徑的考察，常常被忽視。如常作為注射劑中的穩(wěn)定劑或緩沖劑的EDTA、枸櫞酸等，可以與原輔料或生產(chǎn)容器管道中引入的金屬離子（如Fe2+）絡(luò)合，如果輔料或包材中含有抗氧劑（如酚類抗氧劑1010、抗氧劑1076 等），或PVC 輸液管中含有的塑化劑MBHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚，具有還原性），都可能觸發(fā)Udenfriend 反應(yīng)，加速氧化降解。在氧化降解研究工作中，通常采用的試驗條件為：向受試樣品加入20%~30% 的雙氧水少量（如2mL），溶劑溶解樣品至一定容量/室溫/1~2 h。這樣的試驗條件一方面更多地體現(xiàn)了親核氧化途徑的降解情況，另一方面雙氧水濃度過高容易產(chǎn)生人為降解雜質(zhì)，可能與真實降解途徑不符。以氟比洛芬為例（見圖2），在氧化條件下容易生成EP 收載的雜質(zhì)C，而如果氧化條件過于劇烈，會繼續(xù)氧化成EP雜質(zhì)D，甚至EP 雜質(zhì)E，而在藥品常規(guī)儲藏條件下，雜質(zhì)D 和E 由氧化途徑產(chǎn)生的機會不大。因此，氧化降解試驗需考慮試驗條件的劇烈程度以及不同氧化機制的類型，采用適宜的氧化條件進(jìn)行考察。如對于親核氧化，采用0.1%~3% 的雙氧水為氧化劑/中性溶液中/室溫/7 d；對于自由基介導(dǎo)的氧化，采用偶氮類（如AIBN）或過氧化物（如BPO）引發(fā)/暴露于有氧環(huán)境/室溫/7 d，或溶解于金屬離子的鹽溶液（如50 mmol·L-1 的硫酸亞鐵溶液)中/暴露于有氧環(huán)境/室溫/7 d。另外，直接將樣品暴露在自然條件下（合適的光照與溫度）模擬空氣的自然氧化也有助于了解產(chǎn)品的實際氧化情況，但通常需設(shè)置足夠長的考察時間。綜上所述，對各降解類型的試驗設(shè)計與開展進(jìn)行了介紹，但強制降解試驗不一定局限于單一降解類型的試驗條件內(nèi)，可以采取更靈活的方式來更好地預(yù)測產(chǎn)品可能的降解途徑和降解產(chǎn)物。如對于原料藥，可以考察溶液狀態(tài)下產(chǎn)品在各破壞性條件下的變化。必要時還可以進(jìn)行多種降解因素綜合存在時的強制降解試驗，如維生素K 的人工合成品甲萘氫醌二磷酸酯鈉，在一定pH 值水解條件下，首先水解生成甲萘氫醌；進(jìn)而在氧化條件下，甲萘氫醌發(fā)生氧化反應(yīng)，生成甲萘醌（見圖3）。完成強制降解試驗后，應(yīng)根據(jù)試驗?zāi)康呐c藥品特點，對試驗結(jié)果進(jìn)行分析和評估，充分理解試驗結(jié)果對藥物穩(wěn)定特性、處方工藝、雜質(zhì)檢測方法等方面的指示作用，并進(jìn)行相應(yīng)風(fēng)險控制和改進(jìn)優(yōu)化。如光照降解試驗顯示受試樣品降解趨勢明顯，且存在較嚴(yán)重的質(zhì)量不平衡（如回收率低于95%），此時應(yīng)根據(jù)考察結(jié)果分析評估試驗的指示作用，可能還需要結(jié)合影響因素試驗的降解程度和質(zhì)量平衡情況，來判斷光照試驗條件的合理性以及有關(guān)物質(zhì)檢查方法的適用性。另外，試驗結(jié)果顯示受試樣品對光照敏感，就應(yīng)考慮對分析檢測方法及操作、生產(chǎn)工藝、產(chǎn)品處理及存放等環(huán)節(jié)可能出現(xiàn)的風(fēng)險進(jìn)行分析和規(guī)避。本文在參考相關(guān)文獻(xiàn)資料的基礎(chǔ)上，結(jié)合個人工作的理解和認(rèn)識，對強制降解試驗的合理設(shè)計和開展進(jìn)行了初步的探討，建議強制降解試驗需根據(jù)試驗?zāi)康?，基于對各類型降解的先驗知識，結(jié)合具體藥物自身特點，合理設(shè)計和開展，并充分分析理解試驗結(jié)果，從而更全面了解藥物的穩(wěn)定特性和降解途徑，驗證和優(yōu)化有關(guān)物質(zhì)檢測方法，為藥物開發(fā)、生產(chǎn)、包裝、貯藏、使用等提供有益的參考。
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