摘要：由于研究手段的有限性和研究對象的特殊性，流式細胞術成為細胞治療產(chǎn)品研發(fā)中的重要工 具，在細胞產(chǎn)品藥學研究的多方面發(fā)揮著重要作用。本文就細胞治療產(chǎn)品藥學研究中流式細胞術方法開發(fā)的質控要求、樣品處理、熒光偶聯(lián)抗體的選擇抗體定、門控策略等關注點以及流式細胞術目前可參考的方法學驗證一般原則進行論述，以供研究者參考。

一、引言

流式細胞術是一種提供溶液中單個細胞快速多參數(shù)分析的技術，主要利用流式細胞儀進行樣品檢測。經(jīng)典的流式細胞儀由液流系統(tǒng)、光學系統(tǒng)、檢測分析系統(tǒng)三部分組成。流式細胞儀利用激光作為光源來產(chǎn)生散射和熒光光信號，這些信號由光電二極管或光電倍增管等檢測器讀取，轉換成電子信號并由計算機進行分析，最終寫成標準化格式數(shù)據(jù)文件。隨著技術發(fā)展，流式細胞儀從最初的單激光器、單熒光通道發(fā)展到目前大多為多激光器、多通道，可同時進行多色分析，對一個樣品一次進樣可獲得多個細胞標志物信息，使樣品分析更加全面。除經(jīng)典流式細胞儀外，近些年來還出現(xiàn)了更多融合新技術的流式細胞儀，如聲聚焦細胞儀、成像流式細胞儀、質譜細胞儀、光譜流式細胞儀等。

流式細胞術是一個強大的工具，在臨床檢驗、免疫學、分子生物學、微生物學等領域均有較為廣泛的應用。在生物制藥領域的工程細胞株構建和篩選、質量研究、藥動學/藥效學研究等方面，也有較廣泛的應用。自2017年全球首個自體嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）注射液Kymriah（諾華公司）產(chǎn)品上市以來，細胞治療產(chǎn)品出現(xiàn)了研發(fā)熱潮，流式細胞術也成為細胞治療研發(fā)質控中最重要的工具，用于原材料的質量控制、評估復雜體外培養(yǎng)過程中細胞生長的速率、分化狀態(tài)以及最終產(chǎn)品的表征、活力和產(chǎn)品的穩(wěn)定性等?，F(xiàn)階段在細胞產(chǎn)品中應用較多的仍為經(jīng)典的分析型多激光、多色流式細胞儀，新興流式細胞術目前應用還較少?，F(xiàn)結合經(jīng)典流式細胞術自身的技術特點和作為藥物研發(fā)的細胞產(chǎn)品的特點，對細胞治療產(chǎn)品中流式檢測方法開發(fā)的關注點和方法學驗證進行論述。

二、細胞治療產(chǎn)品中流式檢測方法開發(fā)的關注點

（一）設備狀態(tài)與質控

在流式進樣階段之前，應完成設備的狀態(tài)確認。臨床與實驗室標準協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）建議開機即應當對儀器的光學系統(tǒng)、熒光分辨率及熒光強度進行監(jiān)測。流式細胞術的儀器及試劑供應商一般可提供質控微球用來確認設備測定參數(shù)的穩(wěn)定性和均一性。在每次進樣前，可采用熒光微球光路質控品設置和調整儀器光學檢測通道的電壓和增益，確保其處于所設定的可接受范圍內(nèi)。然而由于質控微球與真實分析物具有較大不同，因此質控微球可提供信息的價值也相對有限。除商品化質控微球外，在受監(jiān)管的實驗室還建議使用適當?shù)?/span>質控樣品進行設備狀態(tài)確認?？捎玫馁|控樣品包括商業(yè)化的全血制劑、凍干細胞（外周血單個核細胞、全血細胞、細胞系）、低溫保存的外周血單個核細胞、內(nèi)部制備的對照品、患者或健康供體樣本以及各種新型產(chǎn)品。即使在非監(jiān)管的實驗室，如研究實驗室，一般也推薦進行質控樣品檢測。

（二）樣品處理

細胞產(chǎn)品通常為分離、純化后的細胞，一般直接取樣進行樣本處理即可。取樣時需關注所取樣品的代表性、取樣時樣品的均勻度等，避免取樣帶來的檢測數(shù)據(jù)偏差。由于細胞產(chǎn)品的待檢樣品均為活細胞，如不能立即檢測，需在方法建立之初對取樣后待檢樣品的貯存條件如暫存時間、溫度、光照以及運輸條件（如運輸距離、運輸溫度、振搖情況）等敏感因素進行考察，評估樣本的穩(wěn)定性，以保證檢測數(shù)據(jù)的準確性和可靠性。同時研究人員在進行流式分析時還應關注不同批次樣品中細胞碎片和死細胞的影響，避免因樣品質量差異導致檢測數(shù)據(jù)的偏差。由于細胞治療產(chǎn)品起始原材料中潛在的病原微生物風險，對于流式實驗人員的防護、實驗室環(huán)境和設備的清潔、廢棄物的處理等，均需要符合生物安全的相關規(guī)定。

（三）熒光偶聯(lián)抗體的選擇及用量優(yōu)化

熒光偶聯(lián)抗體是流式檢測中的關鍵試劑之一。不同細胞產(chǎn)品在流式配色的設計上有所不同，研究者一般會結合樣品來源、產(chǎn)品設計、目標標志物的表達情況以及設備配置情況等進行目標細胞群的染色設計。在臨床外周血檢測中，一般使用多色方案進行淋巴細胞亞群分析，如在淋巴細胞亞群檢測中，可采用CD45和/或CD3作為設門抗體，并利用CD4，CD8，CD16和CD56等單抗特異性標記淋巴細胞某一亞群。在細胞治療產(chǎn)品中，除了放行檢測的少量關鍵指標外，流式分析還應該補充使用其他檢測組（panel）進行更進一步非放行目的的表型和功能分析（如趨化因子受體、激活或衰老標記物、細胞內(nèi)因子等），這些補充研究在確定產(chǎn)品更廣泛的表型和功能方面非常有用，也可能是產(chǎn)品未來變更中重要的預判指標。

對于熒光偶聯(lián)抗體的選擇，應結合產(chǎn)品特性和檢測方法，將有文獻報道、權威網(wǎng)站已提供信息或產(chǎn)品說明書中有驗證信息的克隆株作為首選，其他的免疫分析技術，如酶聯(lián)免疫吸附分析、免疫印跡等，也可幫助評估抗體試劑的特異性。同時需關注其來源、克隆、熒光染料等信息。來源不同的抗體，如鼠抗、兔抗等，其非特異性結合情況可能不同。對于常用的免疫細胞表型分析來說，即使是相同的分化抗原（cluster of differentiation，CD）抗體，不同的克隆其抗原結合特性也可能不同。同樣，同一CD抗體，使用不同熒光染料標記，其熒光強度和可能存在的熒光重疊也可能不同。多色熒光分析時，實驗室不僅要驗證每一種單抗的性能，還需要證實其性能不會受抗原封閉處理、熒光淬滅或熒光能量轉移的影響。一般抗體單獨使用和作為組合成分使用時，檢測結果（包括平均熒光強度和陽性率）之間的變化幅度不得超出2倍標準差范圍。對于研究周期長、批次多的項目，熒光偶聯(lián)抗體批次間差異的影響也需要予以充分評估。

熒光抗體的用量和孵育條件也是流式檢測的關鍵參數(shù)。對于市售熒光抗體，試劑生產(chǎn)商一般會建議相應的抗體用量和孵育條件，實際使用中一般會以實際樣品進行抗體用量的優(yōu)化，確保達到最優(yōu)的抗體/細胞用量比。對于染色溫度、時間也應基于不同產(chǎn)品進行優(yōu)化以確定最佳方法參數(shù)。

除了熒光抗體，對于流式細胞術使用的其他試劑，都需充分評估其非特異性結合情況，必要時可使用Fc受體作為阻斷劑。

細胞治療產(chǎn)品在開發(fā)周期內(nèi)，隨著新的、更優(yōu)的商業(yè)化試劑的出現(xiàn)，存在流式檢測抗體進行變更的情況。方法發(fā)生變更后應及時開展方法橋接研究，明確變更對于檢測數(shù)據(jù)的影響，以確認歷史批次數(shù) 據(jù)是否可橋接。不能橋接的數(shù)據(jù)應考慮變更后方法的數(shù)據(jù)量是否足夠支持產(chǎn)品質量標準的擬定。自體細胞產(chǎn)品方法橋接時應考慮個體差異的影響，對研究使用細胞批次數(shù)的合理性應進行說明。

（四）門控策略

在流式的多參數(shù)分析中，門是最為重要的概念之一。對于研究周期長、批次多的項目，熒光偶聯(lián)抗體批次間差異的影響也需要予以充分評估。對于重要的參數(shù)，流式數(shù)據(jù)一般以散點圖、直方圖和等高線圖的形式呈現(xiàn)，分析人員可選擇不同的呈現(xiàn)方式以幫助正確設門。當細胞表面標志物區(qū)分非常明顯時，細胞群邊界較容易區(qū)分，如淋巴細胞亞群分析中CD3，CD4和CD8陽性細胞獨立成像。當細胞群較難區(qū)分時，設門就會非常具有挑戰(zhàn)性，在不同的情況下可能會額外增加陽性和陰性對照、熒光減一對照（fluorescence minus one，FMO）、同型對照（isotype control）、同克隆對照（isoclonie.control）等。門控策略直接影響流式分析的結果，即使是同一個采集數(shù)據(jù)，在不同實驗人員進行設門處理后得到的結果也很難完全一致。因此，在良好實驗規(guī)范（Good Laboratory Practice，GLP）實驗室中，建議在開發(fā)過程中盡可能定義并標準化門控策略和分析模板，以減小數(shù)據(jù)的可變性。同時采用如規(guī)定最小或最大門控邊界、采用對照等策略，既能給予操作人員一定的靈活性又可以防止有意識或無意識的數(shù)據(jù)操作，該要求對于藥物研發(fā)實驗室也可借鑒。對于細胞治療產(chǎn)品，流式分析的門控策略應作為方法標準操作規(guī)范的重要內(nèi)容，在實驗人員培訓、方法轉移等過程中進行詳細的培訓和說明。避免出現(xiàn)同一方法因不同操作人員或不同場地之間的門控策略差異而造成數(shù)據(jù)偏差，從而影響臨床給藥劑量等關鍵指標。

（五）熒光補償

熒光偶聯(lián)抗體熒光素被激發(fā)后的發(fā)射波長范圍可能較寬，此種情況下其光信號可能被多個通道檢測到。因此，當采用雙色或多色分析時需評估不同檢測通道之間的熒光信號干擾，必要時需進行熒光補償調節(jié)，以確保一種熒光素的光信號來自對應的一個檢測通道，同時也要避免過度補償，以防將雙陽性細胞錯誤地識別為單陽性細胞。一般流式檢測方法和設備固定后，針對該方法所建立的補償矩陣也隨之固定下來，由于檢測樣品的異質性，在數(shù)據(jù)分析時可能還需要手動進行補償?shù)奈⒄{。熒光補償除了受熒光素和樣本特異性影響外，還與儀器相關，因此當光學檢測通道的電壓及增益發(fā)生變動時，或當儀器維修保養(yǎng)后，都需要進行熒光補償調整。

（六）殘留干擾

作為藥物進行開發(fā)的細胞產(chǎn)品，在研究階段會出現(xiàn)大量樣品同時檢測的情況。研究者在方法建立時需考慮連續(xù)進樣中樣品的殘留問題，尤其在進行低水平抗原檢測時，評估樣品間的殘留對于樣本檢測數(shù)據(jù)的準確性至關重要。應使用實際樣品明確檢測過程是否有殘留，并設置合理的清潔程序，同時在方法標準操作規(guī)范中應增加相應要求。

三、流式細胞術的方法學驗證

分析方法的驗證是為了證明該分析方法與其預期目的相適應。盡管在藥物研發(fā)早期并無方法學驗證的具體要求，但是有效的、高質量的分析方法對于獲得可靠數(shù)據(jù)進行下游決策必不可少。由于分析方法缺陷導致的不同研究階段數(shù)據(jù)的差異或缺失，會影響研究過程中產(chǎn)品的可比性評價甚至影響臨床給藥量，因此建議研究者盡量在研究早期開展關鍵分析方法的驗證。

在ICHQ2（R2）分析方法論證和2020年版《中華人民共和國藥典》9101分析方法驗證指導原則中，明確了不同類型分析方法典型的驗證指標供研究者參考。目前在細胞產(chǎn)品中常見的流式分析方法類型主要包括鑒別、含量、純度、雜質控制和生物學活性檢測等。由于流式細胞術的預期用途很廣泛，因此目前還沒有一個單一的驗證策略可以使用，建議研究者根據(jù)先驗知識制定符合目的的驗證計劃。同時流式細胞術不同于經(jīng)典的藥物分析方法，樣品和試劑的復雜性、缺少細胞標準品以及設備技術的復雜性等給流式方法學驗證帶來了很多挑戰(zhàn)，因此并非每個典型的驗證參數(shù)都可以用于流式細胞術。對于使用流式細胞術進行的細胞因子分泌檢測一般可獲得檢測標準品，研究者可參考酶聯(lián)免疫檢測方法要求開展驗證，對于細胞產(chǎn)品質量控制中使用流式細胞術進行的細胞表型、殘留等檢測尚無明確的驗證指南，現(xiàn)結合臨床檢測和藥物藥動學/藥效學檢測中對流式驗證的要求，對流式方法學驗證進行簡要論述，供研究者參考。

（一）專屬性

流式細胞術的專屬性主要是考察抗體試劑對目標細胞群識別的特異性。試劑和抗體的特異性可通過檢測包含目的細胞群和非目的細胞樣的合適樣本來進行確認。專屬性的確認一般在方法開發(fā)和優(yōu)化過程中即已完成。

（二）準確度

準確度是測量結果與真實值之間的接近程度。由于缺少標準品，準確度驗證對于流式細胞術的表型分析具有較大挑戰(zhàn)。臨床檢驗中，國際血液學標準理事會（ICSH）和國際臨床細胞術學會（ICCS）工作組建議可采用準確度替代驗證方法，如實驗室間檢測結果的比較、與臨床檢驗其他技術方法的結果進行比較，但由于缺少標準品以及技術的差異，替代方法的價值還有待商榷。在藥效學檢測中，也有研究者認為將驗證的數(shù)據(jù)與文獻參考值進行比對，或采用市售質控品進行檢測并比對參考值，可在一定程度上評估方法的準確度。在藥物研發(fā)中，可使用陽性細胞系制備高水平和低水平的對照，用于評估生物標志物檢測的準確度。但對于臨床檢測來說，由于陽性細胞系與臨床實際樣本有較大差異，因此并不鼓勵使用陽性細胞系。而對于低陽性樣本，可以通過添加少量陽性細胞至陰性樣本中來構建。目前對于細胞產(chǎn)品，研究者可結合方法設計、產(chǎn)品特點以及對照品的獲得情況選擇性開展適用的準確度驗證。

（三）精密度

精密度分為重復性和中間精密度。重復性是指在相同條件下重復測試同一樣品時結果的接近程度。一般建議使用3~6個樣品來進行批內(nèi)精密度驗證，進行1次或多次運行，使用3~6個重復。一般細胞分析的重復性驗收標準為10%~25%CV，對于稀有細胞群或表達水平較低的抗原放寬至30%~35%CV。對于免疫表型分析的檢測方法，ICSH認為一般需控制CV在10%以內(nèi)，較低豐度（1:1000及以下）的細胞群可以放寬至20%。重復性較差可以通過更換單克隆抗體克隆、改變熒光標記或增加采集事件數(shù)來提高精密度。中間精密度考察人員、設備、時間以及實驗室之間等因素的可變性。一般建議中間精密度使用2~6個樣品來驗證，進行3~6次運行，使用3~6個重復，可接受標準為一般<10%，最多<25%[在定量下限（LL0Q）水平或者罕見事件檢測時為30%~35%]。

（四）靈敏度

靈敏度是指樣品中可檢測到的分析物的最低水平。在標準的生物分析方法驗證中，定量方法的靈敏度通過準確性和精確度進行評估。對于流式細胞術，因缺少標準品，評估準確性更具挑戰(zhàn)性，可僅使用精度指標來評估方法的靈敏度。流式細胞術靈敏度一般考察空白限（LOB）、檢測限（LOD）和定量限（LLOQ）。LOB是無目標檢測物的最高檢測信號，通常使用10個陰性樣本進行1次或多次運行的檢測數(shù)據(jù)進行計算，公式為平均值（空白）+1.645SD（空白），95%的陰性樣本低于此限值。LOD是指高于空白的低水平樣本能夠被95%檢出的水平（假設有5%的假陽性和假陰性率），可以通過重復測定低水平樣品計算SD來確定，LOD與LOB密切相關，通常定義為LOB+1.645SD（低陽性樣本）或平均值（空白）+3SD（空白）。LLOQ是能可靠檢測的最低測量水平（如果準確度無法驗證，則使用精密度進行判定），其檢測值不低于LOD。可使用未染色或部分染色的樣本對染色的樣本進行連續(xù)稀釋至LLOQ附近進行測定，還有一種類似方法是將陽性樣品添加至陰性樣品中來制備樣本。對于LLOQ一般要求使用3~6個樣本，每個樣本做5個稀釋度，每個稀釋度每個樣本3~6個重復，進行1次或多次實驗，檢測信號>LOD并且CV≤35%的稀釋度對應的分析物水平作為LLOQ。另外，有研究者認為LLOQ除考慮精密度外，還應滿足門控中的最小采集事件數(shù)（至少20~50），但每個實驗室應根據(jù)驗證數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)的預期用途設定自己的限值。目前在多發(fā)性骨髓瘤、慢性淋巴細胞白血病和其他淋巴增生性疾病中，流式細胞術在檢測少數(shù)腫瘤細胞群體時，LLOQ可達到0.01%水平。

（五）線性和范圍

線性是指標準曲線接近直線的程度。線性范圍是指呈線性的分析物水平的范圍，范圍內(nèi)的點應呈現(xiàn)一定的線性關系，且滿足準確度和精密度要求。由于可用于流式檢測方法的商業(yè)標準品還較少，并且很難獲取極值樣品，因此，流式檢測方法較難開展線性和檢測范圍的驗證。研究者可結合可用的對照品情況以及自身產(chǎn)品特點進行驗證設計。對于一些淋巴細胞表型檢測方法，可使用經(jīng)含量標定的商業(yè)化質控細胞，通過檢測在一定范圍區(qū)間內(nèi)的精密度，對線性及范圍進行評估。對于細胞群表型率檢測的線性，可以將已知陽性的樣本連續(xù)稀釋添加到陰性樣本中來制備線性驗證樣本，采用理論值與檢測值進行線性擬合，評估方法線性及范圍。

（六）耐用性

除了一般的耐用性考慮外，流式分析應特別關注樣本穩(wěn)定性對試驗的影響，如樣品取樣后和樣品染色后的放置穩(wěn)定性，一般認為放置后樣品與基線樣品檢測結果相比變化在20%范圍內(nèi)或精密度滿足CV<30%要求的放置時間可接受。

四、結語

流式細胞術作為單細胞研究的重要工具已有多年的應用經(jīng)驗，而在新興細胞治療產(chǎn)品藥學研究中的應用積累還較少，如何開發(fā)先進的、合規(guī)的流式分析方法也是眾多研究者所關心的課題。隨著越來越多的細胞治療產(chǎn)品進入上市階段，細胞產(chǎn)品藥學研究對流式細胞術的需求也越來越明確，期望業(yè)界和監(jiān)管機構在積累更多細胞治療產(chǎn)品藥學研究中流式細胞術的應用經(jīng)驗后，能逐步形成較明確的流式方法開發(fā)和驗證的規(guī)范性文件以指導實際的細胞藥物研發(fā)工作。