寡核苷酸藥物極性大、水溶性高，不能穿過(guò)細(xì)胞膜，難以分布至靶器官，易被核酸酶降解，需化學(xué)修飾（如硫代磷酸酯）或遞送系統(tǒng)（如 LNP 脂質(zhì)納米顆粒、GalNAc 偶聯(lián)）提高穩(wěn)定性及改善 PK 特征?？傮w而言，寡核苷酸藥物呈現(xiàn)出與傳統(tǒng)小分子或抗體藥物不同的 PK 特性（圖2）。

一、吸收

寡核苷酸藥物通常采用的給藥途徑包括：靜脈注射（IV）或皮下（SC）注射等胃腸外途徑全身給藥，或鞘內(nèi)（IT）或側(cè)腦室（ICV）注射、玻璃體內(nèi)（IVT）注射等局部途徑給藥。

LNPs 包裹的寡核苷酸藥物一般采用 IV 給藥，給藥后從 LNP 中釋放，快速進(jìn)入血液循環(huán)。在一定劑量范圍內(nèi)，穩(wěn)態(tài)暴露水平（C_max 和 AUC）與給藥劑量正相關(guān)。GalNAc 修飾的寡核苷酸藥物通常采用 SC 給藥，給藥后迅速吸收入血并快速達(dá)峰。由于 ASGPR 介導(dǎo)快速分布進(jìn)入肝臟，寡核苷酸藥物從血漿中快速清除，血漿暴露有限。在一定劑量范圍內(nèi)，系統(tǒng)暴露水平（C_max 和 AUC）隨劑量增加而增加；超過(guò)一定劑量后，ASGPR 介導(dǎo)攝取暫時(shí)飽和，攝取至肝細(xì)胞中藥物減少、血漿暴露增加，暴露水平可能會(huì)高于劑量增加比例。

一般來(lái)說(shuō)，非臨床 PK 評(píng)價(jià)中應(yīng)使用預(yù)期的臨床給藥途徑。當(dāng)臨床途徑不是 IV（如 SC、IT 或 IVT 給藥）時(shí)，可能需要開(kāi)展單次 IV 給藥的 PK 研究，以更全面地表征 PK 特性，確定非靜脈給藥時(shí)寡核苷酸藥物的絕對(duì)生物利用度。然而，寡核苷藥物生物利用度與藥效（PD）或毒性相關(guān)性往往比較差，且絕對(duì)生物利用度常因藥物在肝臟中的快速分布而變得復(fù)雜，因此基于血漿暴露評(píng)估寡核苷酸藥物生物利用度不是一個(gè)可靠的方法。監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)絕對(duì)生物利用度測(cè)定的要求并不一致。

寡核苷酸藥物在血漿中 PK 特征不能完全反映靶組織分布、藥效學(xué)特征，呈現(xiàn)出血漿 PK 特征和藥效 PD 脫節(jié)效應(yīng)。單次給藥 24～48h 后，血漿濃度很低但藥效持續(xù)數(shù)十天到數(shù)月。此外，血漿動(dòng)力學(xué)和靶組織效應(yīng)動(dòng)力學(xué)過(guò)程在時(shí)間上不一致，血漿達(dá)峰時(shí)間和最大效應(yīng)時(shí)間通常存在滯后性，即短時(shí)間血漿暴露在組織中產(chǎn)生長(zhǎng)期效應(yīng)。

二、分布

分布研究的主要目的是確定器官和組織中寡核苷酸藥物絕對(duì)和相對(duì)（與毒性或活性的靶器官相比）暴露量特征，了解組織 PK/TK 與 PD 和/或毒性關(guān)系，在非臨床和臨床方案中指導(dǎo)給藥頻率和/或 PK/PD。

2.1 體外血漿蛋白結(jié)合

與小分子藥物作用不同，寡核苷酸與血漿蛋白結(jié)合位點(diǎn)為親水性結(jié)合位點(diǎn)（小分子藥物：疏水性結(jié)合位點(diǎn)），結(jié)合親和力本質(zhì)上基于電荷間相互作用，通常較低且結(jié)合短暫。siRNA 與不同種屬的血漿蛋白結(jié)合率（PPB）相似，且呈現(xiàn)一定濃度依賴性（圖4）。根據(jù) ICH M3（R2），建議在 IND 申請(qǐng)前或 Ⅰ/Ⅱ 期研究期間獲得 PPB 數(shù)據(jù)。

PPB 對(duì) LNP 納米顆粒性質(zhì)、ASPGR 介導(dǎo)的肝細(xì)胞攝取、處置、腎臟的清除影響較小。此外，寡核苷酸藥物通過(guò) LNP（如 Patisiran）或 GalNac 介導(dǎo)的途徑攝取進(jìn)入肝臟，幾乎不受 PPB 影響。攝取進(jìn)入肝臟后，胞漿中游離藥物濃度取決于內(nèi)體中藥物穩(wěn)定性和逃逸效率、肝臟代謝穩(wěn)定性和胞漿蛋白結(jié)合，而非 PPB。因此，無(wú)論是 LNP 還是 GalNac 修飾，PPB 數(shù)據(jù)對(duì)于 PK/PD 都沒(méi)有明顯影響。文獻(xiàn)報(bào)道顯示 siRNA 藥物血漿蛋白結(jié)合率高時(shí)，可能會(huì)短暫延長(zhǎng)部分凝血活酶被活化時(shí)間和補(bǔ)體激活時(shí)間。某些 siRNA 激活補(bǔ)體，可能與 LNP 遞送有關(guān)，而非寡核苷酸本身。

2.2 組織分布

目前，寡核苷酸藥物基于肝靶向設(shè)計(jì)，LNP- 及 GalNAc- 修飾寡核苷酸藥物靶向于肝臟，腎臟、淋巴結(jié)等肝外組織水平較低。SC 給予藥理學(xué)劑量水平 siRNA 時(shí)，與肝臟分布相比，腎臟分布較低（約低 25 倍）。一旦進(jìn)入體循環(huán)，siRNA 藥物迅速攝取進(jìn)入肝臟，在肝臟中 8~24 小時(shí)達(dá)峰（T_max，大鼠：4~8h、猴：8~24h），晚于血漿達(dá)峰時(shí)間、在肝臟中半衰期比血漿中半衰期長(zhǎng)。Lumarisan 在 SD 大鼠及猴肝臟中 T_max 分別為：6h（血漿：1h）、48h（血漿：2.4h），半衰期（t_1/2）分別為 105h（血漿：1h）、409h（血漿：2.6h）。GalNAc- 修飾寡核苷酸藥物藥效與 RISC 復(fù)合物中寡核苷酸藥物濃度及在肝臟半衰期直接相關(guān)，是在不頻繁給藥情況下實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效作用的關(guān)鍵。

全身給藥（IV 和 SC）時(shí)，需進(jìn)行廣泛組織分布評(píng)估，如腎和肝等高攝取組織，特異性靶器官分布也是必要的，通常評(píng)估 4~7 個(gè)時(shí)間點(diǎn)以確定組織半衰期，時(shí)間點(diǎn)包括血漿 T_max、組織 T_max，理想情況下約為 4~5 個(gè)組織半衰期；因此，研究可能會(huì)持續(xù)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，尤其是穩(wěn)定性高的寡核苷酸。

局部給藥時(shí)，應(yīng)確定與給藥部位相關(guān)的組織分布特征（如，IVT：玻璃體液和視網(wǎng)膜層，IT 或 ICV：CSF、腦和脊髓段等）。取樣時(shí)間，應(yīng)仔細(xì)考慮緩慢釋放或儲(chǔ)備效應(yīng)。局部給藥后可能出現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間全身暴露（盡管可能較低）。

若開(kāi)展放射性標(biāo)記組織分布研究，放射性標(biāo)記的位置應(yīng)考慮到代謝和潛在短鏈物質(zhì)。為確保穩(wěn)定性，通常在寡核苷酸每個(gè)分子上標(biāo)記 1~2 個(gè)堿基。雖然放射性標(biāo)記法評(píng)估組織分布比非放射性標(biāo)記法有一定優(yōu)勢(shì)，但價(jià)格更昂貴且時(shí)間成本更長(zhǎng)。若開(kāi)展，經(jīng)典方法是大鼠定量全身放射自顯影（QWBA），但放射性結(jié)果不能區(qū)分活性原藥（或活性代謝物）和非活性代謝物。

三、代謝

通常情況下，寡核苷酸藥物主要經(jīng)廣泛分布于血漿和組織的核酸內(nèi)切酶（Endonucleases）和核酸外切酶（Exonuclease）代謝，水解磷酸酯鍵形成核苷酸片段，而非 Ⅰ 相和 Ⅱ 相代謝酶轉(zhuǎn)化形成。種屬間核酸酶在結(jié)構(gòu)和功能上較為保守，因此，寡核苷酸藥物在不同種屬間代謝途徑和代謝產(chǎn)物相似（圖5、圖6）。由于不同種屬間代謝的一致性，人體特有的代謝物或在人體中比在動(dòng)物試驗(yàn)種屬中存在不成比例的更高水平的代謝物（不成比例的人體代謝物）的可能性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于小分子。

寡核苷酸藥物代謝研究可通過(guò)信息調(diào)研、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估或體外/體內(nèi)代謝研究開(kāi)發(fā)數(shù)據(jù)等。如動(dòng)物組織代謝物數(shù)據(jù)可用于靶向結(jié)合、亦可測(cè)定組織/尿液代謝物，幫助預(yù)測(cè)潛在人體代謝物。

四、排泄

開(kāi)展非臨床排泄研究是為更好指導(dǎo)臨床研究設(shè)計(jì)，以確定原藥及其代謝物的代謝和消除途徑，有助于決定是否在腎臟和/或肝臟損害患者中開(kāi)展臨床研究的必要性。寡核苷酸在組織駐留時(shí)間較長(zhǎng)，在人體中開(kāi)展放射性標(biāo)記的質(zhì)量平衡研究可能不符合倫理。非臨床排泄研究可以用來(lái)代替人體質(zhì)量平衡研究。一般來(lái)說(shuō)，寡核苷酸的排泄途徑往往不那么復(fù)雜，大多數(shù)寡核苷酸主要通過(guò)組織代謝消除，通常只有一小部分作為原形形式排出體外。腎臟排泄程度取決于 PPB 的程度。建議在長(zhǎng)期臨床試驗(yàn)（如 Ⅲ 期臨床）之前確定排泄情況。同時(shí)，可基于平臺(tái)方法，確認(rèn)平臺(tái)中新化合物排泄研究程度。即，若初步研究證實(shí)的結(jié)果與使用該平臺(tái)的先前化合物獲得結(jié)果相似，則不需要對(duì)排泄進(jìn)行深入表征。

五、藥物相互作用

寡核苷酸藥物基于主要 CYP 酶和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體、血漿蛋白結(jié)合率等直接引起相互作用可能性較小，但需關(guān)注藥物作用機(jī)制。目前尚缺乏針對(duì)特定類型的寡核苷酸藥物總體建議，建議根據(jù)作用機(jī)制全面評(píng)價(jià)對(duì)聯(lián)合藥物的潛在影響，充分評(píng)估之間的相互作用。

建議基于平臺(tái)方法對(duì)寡核苷酸藥物開(kāi)展 DDI 研究。對(duì)于寡核苷酸藥物骨架的化學(xué)結(jié)構(gòu)、偶聯(lián)物和/或制劑將至少證明一次體外 DDI 可能性。若結(jié)果為陽(yáng)性，則應(yīng)對(duì)該類型的后續(xù)寡核苷酸藥物開(kāi)展體外 DDI 研究。寡核苷酸的代謝產(chǎn)物主要是短鏈產(chǎn)物，DDI 提出應(yīng)該通過(guò)對(duì)寡核苷酸藥物評(píng)估，對(duì)寡核苷酸藥物代謝產(chǎn)物 DDI 的評(píng)估通常是不合理的。

基于現(xiàn)有小分子藥物和蛋白質(zhì)治療藥物 DDI 指南和文獻(xiàn)，以及 FDA/EMA 迄今批準(zhǔn)的 siRNA 藥物已公開(kāi)信息，對(duì) siRNA 藥物 DDI 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估建議 DDI 決策樹(shù)如圖7所示。將藥物代謝酶、轉(zhuǎn)運(yùn)體或其他蛋白質(zhì)納入 siRNA 的 DDI 評(píng)估，考慮 siRNA 和偶聯(lián)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、賦形劑的化學(xué)性質(zhì)、靶標(biāo)、疾病狀態(tài)和疾病緩解策略，以及靶基因敲除對(duì)藥物代謝酶的潛在上游或下游的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或 siRNA 相關(guān)蛋白（如 GalNAc-siRNA 和 Ago2 的  ASPGR）。

5.1 代謝介導(dǎo)的 DDI

寡核苷酸藥物處置不是經(jīng)肝臟 Ⅰ 相和 Ⅱ 相代謝酶代謝，即不經(jīng)細(xì)胞色素 P450（CYP450）酶代謝。一般而言，寡核苷酸藥物對(duì) CYP 酶不調(diào)節(jié)或調(diào)節(jié)作用較小，基本不受 CYP 酶抑制劑或誘導(dǎo)劑影響。Patisiran 對(duì) CYP2B6 有輕度誘導(dǎo)作用，但誘導(dǎo)能力低且 CYP2B6 底物數(shù)量有限，在臨床顯示產(chǎn)生相互作用可能性較小。寡核苷酸藥物（不包括遞送部分）由內(nèi)切酶和外切酶代謝，目前未發(fā)現(xiàn)是 CYPs 或 UDP- 葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶等常見(jiàn)藥物代謝酶的底物。因此，體外 DDI 評(píng)估寡核苷酸作為藥物代謝酶底物是不必要的。然而，對(duì)于偶聯(lián)的寡核苷酸及 LNP 包裹型寡核苷酸（含新型成分），底物研究可能是必要的。

5.2 轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的 DDI

對(duì)于寡核苷酸藥物吸收、分布和排泄不太可能在主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑產(chǎn)生，無(wú)論類型、化學(xué)性質(zhì)、長(zhǎng)度、偶聯(lián)性等，鮮有證據(jù)表明其是參與跨膜運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要家族的底物。因此，建議至少評(píng)估寡核苷酸藥物作為可能參與組織分布和/或清除途徑的特定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物研究。

盡管報(bào)道有限，與小分子藥物同服時(shí)，寡核苷酸藥物偶聯(lián)物或制劑成分可能通過(guò)非特異性結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性位點(diǎn)，影響轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白空間位阻。研究表明，雖然 IC₅₀ 遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于臨床相關(guān)的游離血藥濃度，但某些寡核苷酸確實(shí)是藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的抑制劑。因此，建議對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白組的抑制作用進(jìn)行評(píng)估。此外，對(duì)于局部給藥的寡核苷酸藥物，需考慮研究給藥位點(diǎn)有關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

5.3 機(jī)制和疾病相關(guān) DDI

應(yīng)考慮基于藥效、間接疾病相關(guān)的藥物相互作用，或直接抑制和誘導(dǎo)，如 ASPGR 和 Ago2 等 siRNA 相關(guān)蛋白的相互作用。當(dāng)引起 PD 效應(yīng)，調(diào)節(jié)藥物代謝酶（如 CYPs 和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）表達(dá)的生化途徑時(shí)，基于機(jī)制的直接效應(yīng)是可能的。

FDA 關(guān)注寡核苷酸藥物可能以間接方式影響 CYP 活性，如干擾血紅素合成、降解或細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)等。建議對(duì) CYPs 和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的潛在影響以及預(yù)期臨床適應(yīng)癥中 CYPs 和/或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)開(kāi)展全面文獻(xiàn)調(diào)研，并根據(jù)需要開(kāi)展相關(guān)研究。

由于寡核苷酸藥物 PD 效應(yīng)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，藥物代謝酶表達(dá)和/或活性調(diào)節(jié)的效應(yīng)都可能被延長(zhǎng)。所以，與治療指數(shù)低且是 CYPs 或藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體底物的同服藥物尤其重要。通過(guò)了解靶基因敲除的上游和下游效應(yīng)和/或預(yù)測(cè)的脫靶沉默效應(yīng)，對(duì)寡核苷酸藥物的基于機(jī)制的效應(yīng)介導(dǎo)的 DDIs 的潛力進(jìn)行逐一評(píng)估。