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AAV 作為一種無包膜細(xì)小病毒，在基因治療領(lǐng)域占據(jù)著重要地位，其應(yīng)用范圍廣泛。重組腺相關(guān)病毒載體（rAAV）通過基因替代、基因沉默和遞送新基因等方式修正遺傳病患者的基因缺陷，展現(xiàn)出諸多顯著優(yōu)勢。它具有較低的整合風(fēng)險(xiǎn)，能夠精準(zhǔn)地靶向多種細(xì)胞，且免疫原性相對較弱^[1]。目前，諸如治療脊髓性肌萎縮癥的 Zolgensma、針對 Leber 先天性黑蒙癥 Ⅱ 型的 Luxturna 等多個(gè)基于 AAV 的基因治療藥物均已上市，這些成功范例為 AAV 基因治療的臨床應(yīng)用筑牢了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，有力地證明了其巨大的潛力與可行性。

眼睛，在人體生理結(jié)構(gòu)中具有獨(dú)特的“免疫豁免”特性，這使其成為基因治療藥物的理想作用靶點(diǎn)：

1) 眼睛具有一定程度的“免疫豁免”特權(quán)

血-房水屏障和血-視網(wǎng)膜屏障宛如堅(jiān)固的防線，有效阻擋了血液中的免疫細(xì)胞、抗體及其他大分子物質(zhì)侵入眼內(nèi)組織，極大地降低了免疫系統(tǒng)對眼內(nèi)環(huán)境的干擾，為 AAV 載體藥物的應(yīng)用營造了相對穩(wěn)定的環(huán)境^[2]。

2) 眼部給藥在手術(shù)操作層面具有較高的可行性

眼部基因治療藥物現(xiàn)階段主要有視網(wǎng)膜下腔注射和玻璃體腔注射兩種注射途徑。

• 視網(wǎng)膜下腔注射能夠精準(zhǔn)地將藥物輸送至光感受器細(xì)胞與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞之間，確保藥物與視網(wǎng)膜直接接觸；

• 玻璃體腔注射則是將藥物注入玻璃體腔內(nèi)，借助藥物在玻璃體液中的自然擴(kuò)散作用，使其順利抵達(dá)視網(wǎng)膜，實(shí)現(xiàn)治療目的^[3]。

3) 眼睛的局部治療優(yōu)勢顯著

由于血-視網(wǎng)膜屏障的存在，藥物難以進(jìn)入全身循環(huán)，從而能夠在眼內(nèi)局部形成較高的載體濃度，增強(qiáng)治療效果。

| 免疫反應(yīng)的啟動(dòng)與類型

與天然感染過程類似，當(dāng)機(jī)體免疫系統(tǒng)識別到外來病原體（如 AAV）后，便迅速啟動(dòng)免疫反應(yīng)，主要分為先天免疫和適應(yīng)性免疫兩大類型。

• AAV 病毒核酸和膜糖蛋白會被模式識別受體（PRRs）敏銳捕捉，進(jìn)而激活核因子 κB（NFκB）和干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF），促使機(jī)體合成促炎細(xì)胞因子和I型干擾素，引發(fā)先天免疫反應(yīng)

• 在先天免疫的基礎(chǔ)上，抗原呈遞細(xì)胞（Antigen-Presenting Cells, APCs）將 AAV 抗原呈遞給 T 和 B 淋巴細(xì)胞，激活這些免疫細(xì)胞并促使其產(chǎn)生免疫記憶，引發(fā)針對 AAV 的特異性適應(yīng)性免疫反應(yīng)，形成了一套嚴(yán)密的免疫防御體系^[5]

| 細(xì)胞免疫機(jī)制

細(xì)胞免疫涵蓋預(yù)存免疫和治療誘導(dǎo)免疫兩個(gè)方面。

• 預(yù)存細(xì)胞免疫可追溯至嬰兒期野生型 AAV 感染，過程中產(chǎn)生記憶 T 細(xì)胞，但具體作用尚不明確

• 在治療誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫過程中，APCs 發(fā)揮著關(guān)鍵的橋梁作用，它將AAV抗原精準(zhǔn)地呈遞給細(xì)胞毒性 CD8⁺ T 細(xì)胞和 CD4⁺ T 細(xì)胞，引發(fā)針對 AAV 感染細(xì)胞的免疫攻擊，這一過程對轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)生重要影響

值得注意的是，在某些特定情況下，細(xì)胞免疫反應(yīng)也可能誘導(dǎo)免疫耐受的產(chǎn)生^[6]。

| 體液免疫機(jī)制

體液免疫的核心執(zhí)行者是 B 細(xì)胞，其產(chǎn)生的抗體具有中和與結(jié)合（非中和）兩種功能。

• 中和抗體（Neutralizing Antibodies, NABs）被定義為能夠抑制病毒的傳染性或致病機(jī)制的抗體

• 結(jié)合抗體（Binding Antibodies, BABs) 或非中和抗體被認(rèn)為缺乏中和活性，但可能參與免疫細(xì)胞的募集和抗體依賴性細(xì)胞毒性的誘導(dǎo)^[7]

抗體可通過多種機(jī)制中和 AAV，如抑制病毒與細(xì)胞結(jié)合、誘導(dǎo)病毒構(gòu)象變化、阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞或干擾病毒的細(xì)胞內(nèi)過程等。

| 眼部免疫特權(quán)與免疫反應(yīng)關(guān)系

在 AAV 基因治療過程中，仍不可避免地會引發(fā)體液免疫反應(yīng)。臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，部分患者在接受治療后出現(xiàn) NABs 水平升高的現(xiàn)象，且這一現(xiàn)象與眼內(nèi)炎癥、T 細(xì)胞反應(yīng)等因素緊密相關(guān)。但目前關(guān)于預(yù)存 NABs 水平與治療后 NABs 誘導(dǎo)之間的內(nèi)在聯(lián)系，以及中和反應(yīng)對基因治療效果和載體再給藥的具體影響機(jī)制尚不清晰，這也成為了當(dāng)前該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)，亟待科研人員進(jìn)一步深入挖掘^[8]。

使眼睛成為有吸引力的靶組織的一個(gè)主要因素是它的相對免疫特權(quán)，這歸因于血液視網(wǎng)膜屏障的存在。雖然臨床研究的初步報(bào)告顯示了 AAV 的治療效果、視力改善和良好的安全性，但后續(xù)研究顯示在臨床前研究和臨床試驗(yàn)中都有炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)可能因多種原因而成為問題，其中之一是免疫機(jī)制可能會清除轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，這使免疫特權(quán)和 AAV 的低免疫原性都受到質(zhì)疑^[9][10]。

| 眼局部炎癥反應(yīng)與抗體水平相關(guān)性

炎癥反應(yīng)是先天免疫系統(tǒng)應(yīng)對病原體或受損細(xì)胞的一種復(fù)雜防御機(jī)制。研究表明^[9][10]，在部分患者中，NABs 水平的顯著增加似乎與眼內(nèi)炎癥的發(fā)作存在關(guān)聯(lián)，前房及玻璃體等炎癥反應(yīng)常出現(xiàn)在藥前與藥后數(shù)周或數(shù)月之間 NABs 滴度變化最大的患者身上。還應(yīng)注意的是，部分發(fā)生眼內(nèi)炎癥的患者藥前 NABs 滴度極低甚至檢測不到。

Divya 等人的研究發(fā)現(xiàn)，向眼內(nèi)注射高劑量 AAV 藥物后，NHP 動(dòng)物眼部出現(xiàn)沉積物和結(jié)構(gòu)異常^[12]。通過對這些動(dòng)物進(jìn)行眼局部免疫反應(yīng)臨床分級，分為無炎癥組、輕度炎癥組和重度炎癥組，然后結(jié)合血清中結(jié)合抗體（BABs）水平進(jìn)行系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)分析，得出以下結(jié)論：

1. 眼局部炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度與“血清結(jié)合抗體水平”高度相關(guān)；與“給藥劑量”中度相關(guān)；與“啟動(dòng)子類型”弱相關(guān)；與“血清型”和“注射方式”無顯著相關(guān)性

2. 各組動(dòng)物在注射后 BABs 水平相較于注射前均有顯著升高，而無炎癥組和重度炎癥組間 BABs 水平更是存在顯著性差異

| 注射后抗體水平變化

rAAV 具有同時(shí)觸發(fā)先天免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的能力，且不同血清型在 APCs 細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)和 T 細(xì)胞激活方面存在明顯差異，多種因素相互交織，共同影響著 T 細(xì)胞反應(yīng)的激發(fā)過程^[13]。

Divya 等人實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，向 NHP 注射 AAV2 載體藥物后，各劑量組動(dòng)物血清中 BABs 水平均有所上升，且呈劑量相關(guān)性；而 NABs 上升水平似乎與劑量閾值相關(guān)，當(dāng)劑量高于閾值時(shí)會引起血清體液反應(yīng)，反之，低于閾值時(shí)則基本不會引起明顯反應(yīng)^[12]。

| 給藥劑量對抗體水平影響

Heier 等人的研究為給藥劑量與抗體水平的關(guān)系提供了重要線索^[11]。在其研究中，低劑量組（2E8-2E9 vg/eye）患者血清中均未檢測到 NABs 水平升高；中劑量組（6E9 vg/eye）患者中，2/3 表現(xiàn)出抗 AAV2 NABs 應(yīng)答；而高劑量組（2E10 vg/eye）患者在長達(dá) 1 年的研究期間，NABs 滴度均呈現(xiàn)升高現(xiàn)象?？梢娫谖词褂妹庖咭种苿┑那疤嵯拢谏鲜鼋o藥劑量范圍內(nèi)，隨著給藥劑量的提高，抗體水平也在隨之上升。

| 注射方式對抗體水平的影響

視網(wǎng)膜下腔注射和玻璃體腔注射這兩種注射方式在免疫反應(yīng)方面存在著一定差異。視網(wǎng)膜下腔位置相對封閉，免疫細(xì)胞分布少；而玻璃體腔內(nèi)的藥物會隨著玻璃體液的流動(dòng)而廣泛擴(kuò)散。因此，相較于視網(wǎng)膜下腔注射，玻璃體腔注射AAV藥物似乎更容易與免疫系統(tǒng)發(fā)生相互作用。

在 Leber 先天性黑蒙癥 Ⅱ 型（LCA2）等疾病的基因治療臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)^[9]，視網(wǎng)膜下腔注射可誘導(dǎo)部分患者產(chǎn)生抗 AAV 體液免疫反應(yīng)，且不同研究中 NABs 水平的變化情況存在差異。部分患者在接受視網(wǎng)膜下腔注射后，NABs 水平升高并伴有眼內(nèi)炎癥，然而也有部分患者未出現(xiàn)明顯的體液免疫反應(yīng)，且 NABs 水平的升高與 AAV 血清型、劑量及患者個(gè)體因素等有關(guān)。

與視網(wǎng)膜下腔注射給藥相比，玻璃體腔注射給藥更易誘導(dǎo)抗 AAV NABs 的產(chǎn)生。在 NHP 研究和臨床試驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)^[14]，玻璃體腔注射給藥后 NABs 水平顯著升高，且具有交叉反應(yīng)性。不同血清型的 AAV 經(jīng)玻璃體腔注射后均可誘導(dǎo) NABs 反應(yīng)，且部分患者的 NABs 水平在治療后可長期維持在較高水平。同時(shí)眼內(nèi)炎癥與 NABs 水平的升高在部分患者中存在關(guān)聯(lián)性。

| 預(yù)存抗體及交叉反應(yīng)影響

約 70% 的人群體內(nèi)存在針對常見 AAV 血清型的 NABs，然而預(yù)存 NABs 的流行率因血清型和地域而異，且具有高度交叉反應(yīng)性^[12]。Divya 等人通過對 41 只食蟹猴血清中的抗體水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，抗 AAV8 抗體水平顯著高于其他測試血清型（AAV2、AAV5、AAV9）^[12]。

此外，部分血清型間存在交叉反應(yīng)現(xiàn)象，當(dāng)注射一種 AAV 血清型，會導(dǎo)致其他血清型的抗體滴度增加，且不同血清型誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)有差異。注射高劑量的病毒更會進(jìn)一步增強(qiáng)對各血清型的抗體反應(yīng)，如注射 AAV2 后，預(yù)存有抗 AAV9 抗體的動(dòng)物血清中抗 AAV9 抗體水平顯著升高^[12][14]。以上結(jié)果提示，如使用重復(fù)利用動(dòng)物進(jìn)行基因治療產(chǎn)品的相關(guān)試驗(yàn)，需明確其給藥史。