大分子生物藥近年來迅猛發(fā)展，特別是抗體藥物偶聯(lián)物（Antibody drug conjugate，ADC）是藥物市場(chǎng)增長(zhǎng)最快的生物藥之一，ADC藥物在腫瘤的靶向治療中發(fā)揮著重要的作用。ADC藥物結(jié)構(gòu)不同（抗體結(jié)構(gòu)、靶點(diǎn)、藥物載荷、連接子和藥物抗體比），在體內(nèi)的表現(xiàn)和給藥策略也不一樣。了解這些藥物在非臨床和臨床研發(fā)階段的藥代和藥效特征，以及免疫原性和安全性，可以對(duì)ADC在體內(nèi)的作用機(jī)制和生物過程進(jìn)行準(zhǔn)確和全面的評(píng)估，從而促進(jìn)安全有效的ADC藥物的開發(fā)。

生物分析為非臨床和臨床研究提供各種關(guān)鍵數(shù)據(jù)，用于計(jì)算和評(píng)估各種藥代/毒代等參數(shù)指標(biāo)，是藥物開發(fā)中的重要環(huán)節(jié)。藥物的生物分析方法應(yīng)穩(wěn)健和可靠，滿足特定研究相關(guān)的樣品檢測(cè)需要，能為非臨床和臨床研究提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

ADC藥物因體內(nèi)代謝復(fù)雜，構(gòu)建合適的ADC生物分析方法需要考慮眾多不同的因素。如對(duì)于定量的分析方法，首先要遵循等分子檢測(cè)的原則，即在相同的分析條件下，一分子的標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生的檢測(cè)信號(hào)與一分子的待測(cè)物產(chǎn)生的檢測(cè)信號(hào)應(yīng)該相同。其次需要明確待分析的分子是游離形式還是總分子，是完整分子還是部分分子。此外，要了解各個(gè)關(guān)鍵試劑對(duì)不同狀態(tài)下的ADC藥物分子的結(jié)合反應(yīng)性，基質(zhì)中是否有游離靶標(biāo)和結(jié)合蛋白的存在；并需要了解類似物與代謝物的情況，以及方法對(duì)抗藥抗體的耐受程度等^[1，2]。

在本中心的生物分析實(shí)踐中，ADC不失為一類對(duì)生物分析方法的開發(fā)具有很大挑戰(zhàn)性的藥物。由于經(jīng)歷分解代謝和生物轉(zhuǎn)化過程，導(dǎo)致ADC藥物在體內(nèi)具有異質(zhì)性，存在著多種形式ADC分子以及多個(gè)ADC藥物的組成分子。因此，對(duì)ADC藥物的分析需要包含ADC以及不同的組分，涉及到多種分析方法。本文例舉在ADC藥物配體結(jié)合生物分析方法開發(fā)工作中遇到的較為常見的技術(shù)問題并提供相關(guān)的解決方案，以期為生物分析人員提供參考，保障ADC藥物評(píng)價(jià)相關(guān)生物分析數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

使用合適的分析方法模式

使用不合適的分析方法模式的錯(cuò)誤一般會(huì)出現(xiàn)在PK（Pharmacokinetics）方法中，特別是對(duì)藥物偶聯(lián)抗體的檢測(cè)。除了脫偶聯(lián)的游離抗體和游離載荷外，ADC在血基質(zhì)中的異質(zhì)性主要表現(xiàn)為存在不同程度與小分子藥物偶聯(lián)的ADC分子。對(duì)于不同分子形式的分析物實(shí)體，比如藥物偶聯(lián)的抗體、抗體偶聯(lián)的藥物、總抗體、未偶聯(lián)的抗體（裸抗）和游離藥物分子，需要使用獨(dú)立的方法進(jìn)行分析。通過比較藥物偶聯(lián)抗體與總抗體的水平可以了解ADC脫偶聯(lián)的程度，而通過比較抗體結(jié)合的藥物分子與總抗體的水平可以得到ADC的平均DAR（Drug antibody ratio）值^[3]。

用于分析藥物偶聯(lián)抗體合適的分析方法應(yīng)以抗小分子藥物的抗體作為包被試劑，再以標(biāo)記的藥靶分子或者抗ADC藥物的獨(dú)特型抗體或抗人IgG Fc抗體作為檢測(cè)試劑，見圖1。該檢測(cè)方法模式體現(xiàn)了等分子檢測(cè)的原則，保證了對(duì)藥物偶聯(lián)抗體的準(zhǔn)確檢測(cè)。

用于分析藥物偶聯(lián)抗體的不合適的分析方模式以靶標(biāo)或者抗ADC藥物的獨(dú)特型抗體或者抗人IgG Fc抗體作為包被試劑，再以標(biāo)記的抗小分子藥物作為檢測(cè)試劑，見圖2。這種方法產(chǎn)生的結(jié)合信號(hào)除了反映ADC分子的數(shù)量外，還受到ADC分子中小分子數(shù)目的影響，該分析模式違反了等分子檢測(cè)的原則，最終將導(dǎo)致藥物偶聯(lián)的抗體的檢測(cè)不準(zhǔn)確。

ＡＤＣ總抗體分析方法

受 ＤＡＲ值的影響

ADC總抗體的檢測(cè)中包含對(duì)藥物偶聯(lián)的抗體和藥物未偶聯(lián)的抗體（裸抗）兩種組分的分析，其中藥物偶聯(lián)的抗體存在異質(zhì)性。在構(gòu)建總抗體的分析方法時(shí)，應(yīng)避免使用對(duì)偶聯(lián)抗體和裸抗存在差異結(jié)合的關(guān)鍵試劑，否則總抗體分析方法的準(zhǔn)確性會(huì)受到影響^[4]。

在圖3的方法1中以靶抗原作為包被試劑，以標(biāo)記的抗人IgG為檢測(cè)試劑，結(jié)果顯示未偶聯(lián)抗體的結(jié)合信號(hào)明顯高于藥物偶聯(lián)的抗體的結(jié)合信號(hào)，說明方法1中的關(guān)鍵試劑對(duì)藥物偶聯(lián)的抗體和裸抗的結(jié)合反應(yīng)存在差異；然而，當(dāng)方法1中的標(biāo)記抗體更換為標(biāo)記的抗人IgG Fc的抗體時(shí)，未偶聯(lián)抗體的結(jié)合信號(hào)與藥物偶聯(lián)的抗體的結(jié)合信號(hào)基本一致（方法2），說明方法2中的關(guān)鍵試劑對(duì)藥物偶聯(lián)抗體和裸抗的結(jié)合反應(yīng)不存在差異，是檢測(cè)總抗體的正確方法。綜合2種方法的檢測(cè)結(jié)果，可見造成方法1中的未偶聯(lián)抗體和偶聯(lián)抗體的結(jié)合信號(hào)差異的原因來自標(biāo)記的抗人IgG試劑。

ADC分析方法受DAR值的影響

對(duì)于ADC分子而言，給藥后體內(nèi)DAR值因脫偶聯(lián)而隨時(shí)間變化，總體來說，DAR值在ADC給藥后趨向變小。因此，導(dǎo)致定量分析的ADC參考標(biāo)準(zhǔn)品與體內(nèi)研究樣品中的ADC的DAR值互不相同，這種差異在給藥后期（比如PK試驗(yàn)）的時(shí)間點(diǎn)采集的樣品中表現(xiàn)得尤為明顯。如果在ADC檢測(cè)中使用的關(guān)鍵試劑受到DAR值不同的影響，那么ADC的濃度將不能代表分析物的真實(shí)濃度，從而影響研究數(shù)據(jù)的解讀^[3]。

圖4中所示的ADC分析方法是以抗小分子藥物的F(ab’)₂作為捕獲試劑，抗人IgG Fc的抗體作為檢測(cè)試劑來構(gòu)建的。結(jié)果發(fā)現(xiàn)方法在DAR值為4以下時(shí)影響較小，但當(dāng)DAR值增加到6時(shí)，信號(hào)值明顯下降。因此，采用DAR值為4的ADC作為標(biāo)準(zhǔn)品開發(fā)的分析方法基本不受DAR值的影響。

另一個(gè)例子中的ADC分析方法以抗小分子藥物作為捕獲試劑，靶蛋白和靶蛋白表面的標(biāo)簽以及標(biāo)記的抗標(biāo)簽抗體為檢測(cè)試劑，見圖5。這里的標(biāo)記試劑利用了靶蛋白分子上的標(biāo)簽分子，而不是直接使用生物素或HRP標(biāo)記的靶蛋白作為檢測(cè)試劑，原因是生物素或HRP標(biāo)記的靶蛋白顯著地失去了與ADC結(jié)合的能力。相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以DAR值為8的ADC作為分析的參考標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，DAR值為4的ADC的檢測(cè)未見受到影響。該項(xiàng)目中未能獲得DAR值為2的ADC測(cè)試物用于更低DAR值影響的評(píng)估，但由于DAR值為8和4時(shí)時(shí)ADC與靶蛋白的結(jié)合相當(dāng)，鑒于該ADC分子為定點(diǎn)偶聯(lián)產(chǎn)品，故認(rèn)為在低DAR值情形下ADC與靶蛋白的結(jié)合很大概率不會(huì)受到影響。

ADC的分析方法

受小分子狀態(tài)的影響

ADC生物分析的挑戰(zhàn)性還可源于與抗體偶聯(lián)的小分子的狀態(tài)。ADC在體內(nèi)經(jīng)歷的生物轉(zhuǎn)化和分解代謝過程可能使ADC分子上的小分子毒素的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，生成小分子毒素代謝轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞毒性增加或降低的ADC分子。相應(yīng)地，在循環(huán)中會(huì)有2種游離小分子毒素的存在，即未代謝轉(zhuǎn)化的毒素分子和代謝轉(zhuǎn)化后的毒素分子（即毒素代謝產(chǎn)物）。由于總抗體和總ADC濃度反映藥物在體內(nèi)的有效性和靶毒性，因此，在這種狀態(tài)下的大分子生物分析指標(biāo)應(yīng)該檢測(cè)總抗體，小分子毒素未被代謝轉(zhuǎn)化的ADC分子（即ADC產(chǎn)品本身）和小分子毒素被代謝轉(zhuǎn)化過的ADC分子。由于游離小分子毒素的水平與體內(nèi)的非靶毒性相關(guān)，那么對(duì)游離小分子毒素的生物分析也應(yīng)包含修飾過的小分子毒素和未修飾過的小分子毒素。Faria等報(bào)道^[5]ADC的小分子毒素分子上有一個(gè)酯基團(tuán)易被裂解導(dǎo)致去乙?；纬尚揎椷^的小分子毒素，見圖6。

研究發(fā)現(xiàn)乙?；鶊F(tuán)的缺失會(huì)導(dǎo)致小分子毒素的效力顯著減低，并且小分子毒素的去乙酰化可以在與抗體結(jié)合時(shí)發(fā)生，從而生成小分子毒素去乙?；x轉(zhuǎn)化后的ADC。另外，小分子毒素的去乙?；部梢栽谄鋸目贵w中釋放后發(fā)生，是毒素分子代謝產(chǎn)物的一種來源。在這類產(chǎn)品的臨床樣品中對(duì)ADC分子進(jìn)行PK評(píng)估時(shí)，需要開發(fā)并驗(yàn)證幾種不同的生物分析方法來分析總抗體，ADC產(chǎn)品本身，小分子毒素代謝轉(zhuǎn)化后的ADC，游離小分子毒素和小分子毒素代謝產(chǎn)物。

近年來，ADC趨向于采用更高的DAR值和效力較低的細(xì)胞毒素來設(shè)計(jì)^[6]。例如，使用SN?38作為有效載荷的靶向TROP2的Sacituzumab Govitecan（IM?MU?132）和以DXd為有效載荷的靶向HER2的Tras?tuzumab Deruxtecan（T?DXd）已分別成為治療三陰性乳腺癌和HER2高表達(dá)或低表達(dá)乳腺癌的有效ADC，說明了喜樹堿類衍生物（SN?38或Dxd）作為有效載荷的優(yōu)勢(shì)，使得喜樹堿衍生物成為ADC領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一^[7，8]。

關(guān)于喜樹堿類ADC藥物的分析方法，除了需要考慮上面提到的相關(guān)因素外，還需考慮分子中內(nèi)酯環(huán)開閉對(duì)方法的影響。SN38是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I的抑制劑，分子中有A，B，C，D，E五個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，見圖7，其中E環(huán)為內(nèi)酯環(huán)，是主要的活性基團(tuán)，但結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，內(nèi)酯環(huán)具pH依賴性，在pH上升時(shí)會(huì)打開，內(nèi)酯環(huán)打開時(shí)喜樹堿失去生物活性[9]。

內(nèi)酯環(huán)的開閉會(huì)給ADC的分析方法帶來影響，但在下面2種情況下，見圖8，這種影響可以不考慮^[10]。

（1）如果連接子與SN38內(nèi)酯環(huán)羰基α位羥基連接，那么羥基與羰基氧之間的分子內(nèi)氫鍵的形成會(huì)被阻止，內(nèi)酯環(huán)穩(wěn)定地處于閉環(huán)狀態(tài)，這樣便導(dǎo)致體內(nèi)僅有-種分子形式存在。

（2）如果連接子與羰基α位以外的基團(tuán)連接，那么分子內(nèi)氫鍵形成，內(nèi)酯環(huán)打開，但如果針對(duì)SN38的抗體的反應(yīng)表位不含內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)，那么內(nèi)酯環(huán)開閉便對(duì)這類抗體沒有作用。

除以上這2種情況外，需要考慮內(nèi)酯環(huán)開閉對(duì)ADC分析方法的影響，原因是：

（1）標(biāo)準(zhǔn)品與真實(shí)樣品間內(nèi)酯環(huán)型和羧酸鹽型分子的比例不一致；

（2）不同時(shí)間點(diǎn)采集的樣品中的2種形式喜樹堿分子的比例不同；

（3）抗喜樹堿類小分子的抗體與開閉環(huán)喜樹堿分子的反應(yīng)性不同，產(chǎn)生不同水平的信號(hào)值。

在一個(gè)專題的預(yù)實(shí)驗(yàn)樣品的分析中，得到的ADC的濃度數(shù)倍于總抗的濃度，明顯受到了內(nèi)酯環(huán)開閉的影響，見圖9。

對(duì)于內(nèi)酯環(huán)開閉的影響，解決方案是使用酸化策略，即先對(duì)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行酸化處理，使喜樹堿分子都處于同樣的閉環(huán)狀態(tài)，然后進(jìn)行中和處理，中和后的樣品進(jìn)入配體結(jié)合分析，我們將這種分析策略應(yīng)用在所有的喜樹堿類ADC藥物的分析中。圖10是酸化策略在兩個(gè)喜樹堿類ADC藥物的應(yīng)用示例，結(jié)果顯示無(wú)論是單次給藥還是多次給藥，ADC的濃度均略小于總抗的濃度，且這種情況貫穿了研究的始終^[11]。

PK分析方法受抗藥抗體的影響

PK方法受ADA（Anti?drug antibody）的影響是較為常見的問題。ADA可以通過空間位阻影響分析方法中的抗體與藥物的結(jié)合而影響PK分析方法的性能；如果是中和抗體，那么ADA會(huì)影響捕獲抗原或獨(dú)特型抗體與藥物的結(jié)合，造成檢測(cè)濃度降低。

圖11中呈現(xiàn)的一個(gè)實(shí)例顯示樣品中的ADA既影響到TAb的分析結(jié)果也影響到ADC的分析結(jié)果。從2種方法的構(gòu)建所涉及的關(guān)鍵試劑看，ADA對(duì)檢測(cè)抗體的影響可能性較大，但對(duì)包被抗原和抗小分子抗體的影響也不能完全排除。

那么在什么情況下需要建立不受ADA影響的PK分析方法，關(guān)于這個(gè)問題，首先需要預(yù)測(cè)一下ADA耐受的PK方法是否能夠提供更加關(guān)鍵和富含更多的信息。如果能夠提供，那么需要去開發(fā)ADA耐受的方法。如果不能提供，需開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)的PK方法，但要評(píng)估ADA對(duì)結(jié)果的影響情況。在獲取PK、PD、ADA、毒理和藥效數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，做PK的相關(guān)分析。分析藥物水平與PK、PD、安全性和藥效的相關(guān)性。如果相關(guān)，報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)PK分析方法的分析結(jié)果；若不相關(guān)，那么在非臨床研究中，要調(diào)查在大多數(shù)動(dòng)物中，是否觀察到早期或足夠高的ADA發(fā)生率影響了初始的藥物暴露特征/水平。在臨床研究中，需關(guān)注發(fā)生不良反應(yīng)ADA陽(yáng)性受試者的藥物暴露是否被低估。當(dāng)藥物暴露量與毒性或者藥效不成比例時(shí)，比如暴露量小，但卻呈現(xiàn)明顯的毒性或者藥效，這時(shí)需要考慮開發(fā)ADA耐受的PK分析方法^[12]。

免疫原性域特異性分析的結(jié)果

會(huì)隨分析模式的不同而異

對(duì)ADC的ADA域特異性的分析，通常可用2種方法：

（1）表位競(jìng)爭(zhēng)法；

（2）表位標(biāo)記法。

前者在橋接ADA方法中添加未標(biāo)記的含域測(cè)試物，以消耗相應(yīng)的抗藥抗體，從而產(chǎn)生抑制信號(hào)；后者在橋接ADA方法中使用標(biāo)記的含域測(cè)試物取代原來標(biāo)記的藥物分子，從而可以直接結(jié)合相應(yīng)的抗藥抗體，形成抗原夾心，產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)合信號(hào)^[13]。值得一提的是，使用表位競(jìng)爭(zhēng)法時(shí)，ADA中針對(duì)次要表位的抗體會(huì)受到針對(duì)主要表位的抗體的影響而基本上不能被檢測(cè)出來，但如果使用表位標(biāo)記法進(jìn)行檢測(cè)的話，針對(duì)次要表位的抗體的檢測(cè)基本上不受影響^[13]。

ADA分析方法的藥物耐受性不夠

ADA方法經(jīng)常遇到的問題是藥物耐受性不高。游離藥物會(huì)與抗藥抗體結(jié)合而形成復(fù)合物，從而影響到ADA方法的檢測(cè)，出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。有多種技術(shù)手段可以改善ADA方法的藥物耐受性，比如圖12所列舉的幾種方法^[14]。通常會(huì)有一種技術(shù)手段能夠取得較好的效果。

常規(guī)使用BEAD(Bead extraction with acid disso?ciation)技術(shù)手段的ADA方法，即用固化有藥物的磁性微球從酸解并中和的樣品中提取ADA，再用橋接方法對(duì)ADA進(jìn)行分析。圖13顯示這種技術(shù)手段在兩種ADC藥物的ADA分析方法中的藥物耐受濃度在高水平ADA時(shí)（4000~8000ng·mL^-1）可以超出1mg·mL^-1，在低水平ADA時(shí)（100ng·mL^-1）可達(dá)200μg·mL^-1，基本上能夠滿足絕大部分的ADA分析的要求。