【摘要】　病毒清除驗證是生物制品病毒安全性的重要保障之一。 目前，在臨床試驗階段或申報上市階段采用工藝平臺作為病毒清除能力的驗證策略已被ICH Q5A（R2）接受。 病毒清除工藝平臺驗證技術(shù)，可以允許開發(fā)者在基于科學(xué)與風(fēng)險的前提下適當(dāng)減少臨床前藥物在病毒清除方面的驗證研究，為申請人提供開發(fā)和申報過程中的時間和成本優(yōu)勢。 但與此同時，如何建立和應(yīng)用工藝平臺，對申請人的工藝?yán)斫夂蜕a(chǎn)經(jīng)驗提出了更高的要求和挑戰(zhàn)。本文將圍繞病毒清除工藝平臺的前期風(fēng)險評估、建立方法、應(yīng)用等關(guān)鍵階段，結(jié)合相應(yīng)的案例分析，以期為該技術(shù)的開發(fā)和評價提供引導(dǎo)和實用參考。

【關(guān)鍵詞】　病毒清除；工藝平臺驗證技術(shù)；多因素正交分析法；案例法

［中圖分類號］ R95　?。畚墨I標(biāo)志碼］ Ａ　　

［文章編號］ 1003－3734(2025)06 – 0602 - 06

生物制品的病毒安全性是產(chǎn)品全生命周期的藥學(xué)關(guān)注重點，而病毒清除驗證是確保生物制品病毒安全性的重要技術(shù)手段之一，也是生物制品生產(chǎn)工藝中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 以往，申請人一般采用開展擬申報產(chǎn)品的特異性驗證，以證明其特定工藝步驟對潛在病毒清除能力的穩(wěn)健性。然而，隨著對病毒清除相關(guān)工藝步驟理解的不斷深化，采用病毒清除工藝平臺驗證進行病毒安全性評估逐步獲得認(rèn)可，也有越來越多的國家或地區(qū)開始接受以平臺驗證的形式進行相關(guān)申報。 在此背景下，為規(guī)范和指導(dǎo)病毒清除工藝平臺驗證技術(shù)應(yīng)用，國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心于2024年１月發(fā)布了《治療用重組生物技術(shù)產(chǎn)品病毒清除工藝平臺驗證技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》[1]（以下簡稱為指導(dǎo)原則）。 本文旨在基于該指導(dǎo)原則的監(jiān)管考量和框架，對臨床試驗申請階段工藝平臺的建立進行案例解析，以期為業(yè)界建立工藝平臺提出科學(xué)建議。

病毒清除工藝平臺驗證，系指在所包括的各單元操作均在一組廣泛的因素集內(nèi)具有穩(wěn)健的病毒清除能力。 當(dāng)滿足特定和嚴(yán)格的工藝和產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)時，允許相似的產(chǎn)品和工藝在相似的工藝步驟中應(yīng)用模型病毒清除的性能。 工藝平臺可以由1個或多個工藝模塊組成，目前主要接受采用溶劑/去污劑滅活、低pH滅活和病毒截留過濾步驟建立工藝模塊。本文將結(jié)合典型案例解析，圍繞工藝平臺/模塊建立的前期風(fēng)險評估、建立方法和應(yīng)用進行闡述。

1  工藝平臺/模塊建立的前期風(fēng)險評估

在準(zhǔn)備建立工藝平臺/模塊前，建議研發(fā)者對影響病毒清除效果的因素進行全面的了解和風(fēng)險評估。病毒清除驗證的代表性主要由以下因素組成：生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)、指示病毒、驗證用樣品和工藝參數(shù)。因此，工藝模塊的建立應(yīng)圍繞以上因素進行明確或開展相關(guān)研究，特別是對于工藝參數(shù)因素，由于其內(nèi)含種類較多且在不同產(chǎn)品間變異性較強，是工藝模塊設(shè)計空間探索研究的重點。

生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)方面，指導(dǎo)原則中已進行明確，即采用來源于相同生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)產(chǎn)品的驗證數(shù)據(jù)方可組合為同一數(shù)據(jù)集用于支持工藝模塊的建立。需要說明的是，以目前廣泛使用的CHO細(xì)胞為例，其亞型視為同一細(xì)胞基質(zhì)，而研發(fā)者額外對宿主細(xì)胞進行基因修飾則不可視為同一細(xì)胞基質(zhì)?；蛐揎棽僮髦袧撛诘拿摪行?yīng)可能對宿主細(xì)胞的基因組進行非預(yù)期的編輯[2]，其生產(chǎn)的產(chǎn)品可能會呈現(xiàn)不同的雜質(zhì)種類、內(nèi)源性病毒載量水平，以上差異會影響特定步驟對病毒的清除效率。 此外，如采用病毒載體介導(dǎo)基因修飾，則可能影響指示病毒的代表性；指示病毒方面，采用相同指示病毒的驗證研究方可納入同一工藝模塊的驗證數(shù)據(jù)集合。文獻報道或業(yè)界經(jīng)驗均顯示，即使參數(shù)相同的清除步驟對于不同指示病毒（即使其理化性質(zhì)相似）的清除能力仍可能存在差異[3]；產(chǎn)品（工藝中間體）方面，特定步驟中間體的部分質(zhì)量屬性可能會對該步驟的病毒清除能力產(chǎn)生不良影響，建議申請人關(guān)注低pH滅活步驟中的蛋白質(zhì)濃度、病毒截留過濾步驟中可能影響樣品黏度或微粒形成的潛在因素[4]和S/D滅活步驟的產(chǎn)品聚集體或顆粒狀物質(zhì)等，并在工藝模塊建立和應(yīng)用過程中對以上質(zhì)量屬性進行表征和代表性評估。

工藝參數(shù)方面，模塊化工藝驗證研究中，工藝參數(shù)類型的選擇是整體研究的關(guān)鍵。 納入工藝參數(shù)類型的數(shù)量與驗證工作量和工藝模塊對其他類似產(chǎn)品的適用范圍成正比，建議研發(fā)者根據(jù)計劃應(yīng)用平臺驗證的多個相似產(chǎn)品的工藝變異性，合理擬定驗證參數(shù)類型，使驗證模型與實際應(yīng)用相協(xié)調(diào)。以低pH滅活和病毒截留過濾步驟為例，結(jié)合ICH Q5A和指導(dǎo)原則，建議關(guān)注的工藝參數(shù)見表1。

表1 建議關(guān)注的低pH滅活和病毒截留過濾步驟工藝參數(shù)類型

a: 工藝中斷是指在除病毒過濾過程中，跨膜壓差降至0后再恢復(fù)至目標(biāo)值并完成過濾，該情況有可能導(dǎo)致病毒穿透[5]。由于發(fā)生工藝中斷的原因可能是預(yù)期內(nèi)（中間體分批過濾）或非預(yù)期（如停電）的，且并非存在于多數(shù)案例中，建議在正交法建立工藝模塊研究中對工藝中斷進行研究

建議研發(fā)者依據(jù)先驗知識、申報產(chǎn)品/工藝特點綜合評估需納入驗證研究的工藝參數(shù)。未納入的，建議在申報資料中明確具體參數(shù)，應(yīng)采用指導(dǎo)原則中的推薦條件或在各組合條件下保持一致，后續(xù)計劃采用該數(shù)據(jù)包的產(chǎn)品所采用的實際參數(shù)也應(yīng)在推薦或驗證的范圍內(nèi)。

2  工藝平臺/模塊的建立方法

單個工藝模塊的建立可以采用2種方法：開展病毒清除工藝設(shè)計空間驗證研究的多因素正交分析法或?qū)韧a(chǎn)品的病毒清除數(shù)據(jù)進行回顧性分析的案例法。 本文將以低pH滅活和病毒截留過濾步驟為例，對如何使用多因素正交分析法和案例法建立工藝模塊進行進一步闡述。

2.1 多因素正交分析法　 多因素正交分析法是一種科學(xué)的驗證策略，通過系統(tǒng)地分析并設(shè)置多個工藝參數(shù)，形成特定病毒清除步驟的工藝參數(shù)設(shè)計空間，再通過括號法或矩陣法對代表性的工藝參數(shù)組合進行工藝表征和驗證，確保特定步驟病毒清除能力的穩(wěn)健性，最終將來自該方法研究的模塊化病毒清除數(shù)據(jù)應(yīng)用于其他項目。

首先，應(yīng)分析并設(shè)計對工藝模塊具有代表性的工藝參數(shù)組合。以括號法為例，將多個重要工藝參數(shù)的上限和下限進行合理組合，形成一組可以代表該模塊設(shè)計空間的檢測集合。值得注意的是，每增加1種工藝參數(shù)至正交試驗中，都可能意味著組合數(shù)量成倍增長。事實上，根據(jù)作用機制或?qū)嵺`經(jīng)驗，部分單一因素對于病毒清除能力的影響比較明確且穩(wěn)健，如低pH滅活步驟中的pH值、孵育溫度和孵育時間等[6]，因此筆者建議該類參數(shù)可不采用括號法，而是于各組合中直接采用“最差情況”作為固定參數(shù)，以精簡研究。

正交試驗設(shè)計完成后，應(yīng)對各組合條件進行病毒清除驗證，該部分的要求與各相關(guān)法規(guī)文件和指導(dǎo)原則基本一致，每個組合需進行2次運行，采用原理相同的檢定方法。最后得到各組合條件下對指示病毒的病毒滴度對數(shù)下降值(log reduction value, LRV)，選擇所有結(jié)果中的最低LRV作為該工藝模塊應(yīng)用時聲明的LRV，并以此LRV作為有效步驟認(rèn)定和安全因子范圍計算的依據(jù)。

舉例如下：低pH滅活步驟中，采用pH=3.60、孵育溫度15℃、孵育時間60min作為固定條件，正交組合設(shè)計和檢測結(jié)果見表2。

表2 正交法設(shè)計低pH滅活步驟參數(shù)組合示例

a: 以檢測到的最低LRV：5.23，作為該工藝模塊聲明的LRV

病毒截留過濾步驟中，采用同品牌同型號濾膜、產(chǎn)品中間體的體積通量為600L·（m²）^-1、沖洗過濾器用緩沖液的體積通量為100L·（m²）^-1、工藝中斷1次作為固定條件，正交組合設(shè)計和檢測結(jié)果見表3。

表3 正交法設(shè)計病毒截留過濾步驟參數(shù)組合示例

ａ：以檢測到的最低LRV：5.05，作為該工藝模塊聲明的LRV

檢測完成后，可根據(jù)正交試驗覆蓋的工藝參數(shù)范圍建立工藝模塊。 以上文中的例子建立的工藝模塊見表4。

表4 正交法建立工藝模塊示例

2.2 案例法　 案例法要求申請人具有多個相似產(chǎn)品的病毒清除驗證研究經(jīng)驗，對既往數(shù)據(jù)進行回顧性地匯總和分析，此處同樣以低pH滅活和病毒截留過濾步驟為例進行闡述。

低pH滅活：所有項目均為IgG1亞型并采用60min的孵育時間（見表5）。

表5 案例法設(shè)計低pH滅活步驟參數(shù)組合示例

a: 以檢測到的最低LRV: 6.17，作為該工藝模塊聲明的LRV

病毒截留過濾：所有項目均為IgG1亞型并采用相同型號的濾膜（見表６）。 結(jié)合檢測到的最低LRV所對應(yīng)的工藝參數(shù)組合以及指導(dǎo)原則中推薦的工藝參數(shù)范圍，擬定工藝模塊的具體參數(shù)（見表7）。

表6 案例法設(shè)計病毒截留過濾步驟參數(shù)組合示例

ａ：以檢測到的最低LRV: 4.89，作為該工藝模塊聲明的LRV

表7　案例法建立工藝模塊示例

此處需注意，對于病毒截留過濾中的跨膜壓力參數(shù)，由于不同濾膜品牌跨膜壓力的最差條件不同（低/高壓有泄漏風(fēng)險），因此采用案例法建立的工藝模塊中，跨膜壓力的參數(shù)范圍擬定建議結(jié)合供應(yīng)商提供或研發(fā)者自行開展的相關(guān)驗證研究結(jié)果合理擬定，并于溝通交流或申報資料中提供相關(guān)依據(jù)。

此外，S/D滅活目前也可被接受用于建立工藝模塊，本文中雖未對該步驟進行舉例分析，但工藝模塊建立的整體設(shè)計思路與低pH滅活步驟基本相似。S/D滅活模塊額外需要注意的問題是，由于樣品中可能存在聚集或顆粒狀物質(zhì)并將病毒包裹其中，導(dǎo)致S/D試劑無法接觸到病毒，進而對該步驟的滅活能力產(chǎn)生不利影響[7]。因此在S/D滅活工藝模塊的建立和應(yīng)用中，均要求對待滅活樣品進行一次0.2μm過濾預(yù)處理，以規(guī)避上述風(fēng)險。其余參數(shù)方面，推薦的S/D滅活條件可參考指導(dǎo)原則。

3  工藝模塊的應(yīng)用

擬申報產(chǎn)品在進行平臺驗證時，特定步驟的所有工藝參數(shù)必須被相應(yīng)工藝模塊內(nèi)經(jīng)驗證的工藝參數(shù)范圍覆蓋，方可應(yīng)用平臺驗證。申報資料中應(yīng)列表明確擬申報產(chǎn)品的工藝參數(shù)控制范圍和代表性批次的實際工藝參數(shù)，并與工藝模塊參數(shù)進行對比，全面評估工藝模塊對擬申報產(chǎn)品的代表性或適用性。列表舉例見表8。

表8 工藝模塊應(yīng)用示例

需要明確的是，無論病毒截留過濾工藝模塊建立的結(jié)果如何，應(yīng)用之前，要求采用細(xì)小病毒作為指示病毒，進行一次針對擬申報產(chǎn)品的代表性確認(rèn)驗證研究。

４  討論

展望該技術(shù)的未來發(fā)展，從工藝平臺驗證技術(shù)適用范圍的角度來看，除目前主要被接受的以滅活或過濾為清除機制的工藝模塊外，相信隨著行業(yè)對病毒清除工藝?yán)斫獾牟粩嗉由詈推脚_驗證申報/審評經(jīng)驗的逐漸豐富，以基于電荷差產(chǎn)生的靜電吸附作用或分子間特異性相互結(jié)合為清除機制的層析步驟也有望被用于建立工藝模塊。采用層析步驟建立工藝模塊，其建立方法基本遵循上文論述的前期風(fēng)險評估、正交法/案例法研究的思路。以被廣泛地認(rèn)為是有效病毒清除步驟的陰離子層析為例，該步驟清除病毒的原理為利用目的蛋白與病毒的等電點差異以實現(xiàn)兩者的分離?；谠撟饔脵C制，對于既定的層析介質(zhì)，可以通過調(diào)節(jié)上樣pH和電導(dǎo)率改變樣品的表面電荷，使陰離子層析以流穿和結(jié)合/洗脫等工作模式運行。 由于在不同的工作模式下，部分工藝參數(shù)的“最差情況”可能完全不同[8]，建議采用同一工作模式的組合/案例建立工藝模塊。以多因素正交分析法建立流穿模式陰離子層析工藝模塊為例，建議考慮固定其他參數(shù)（如保留時間、載量、層析介質(zhì)型號、目的蛋白等電點）為最差情況（如有此種情況），對上樣pH與上樣電導(dǎo)率進行正交的設(shè)計空間探索，關(guān)注不同組合條件下對指示病毒的LRV，并通過檢測目的蛋白流穿/結(jié)合比例以表征特定條件下的工作模式。另外，不同于清除能力更加穩(wěn)健的低pH滅活和病毒截留過濾步驟，對于陰離子層析而言，由于高/低分子量物質(zhì)、宿主細(xì)胞殘留蛋白/DNA均帶有表面電荷，其可以與病毒競爭性結(jié)合層析介質(zhì)[9]，進而影響病毒清除能力，因此該步驟上樣樣品中產(chǎn)品/工藝相關(guān)雜質(zhì)的水平不是在某些條件下可以被忽略的影響因素?；谝陨显?，無論采用多因素正交分析法或案例法建立工藝模塊，均建議結(jié)合驗證數(shù)據(jù)評估上樣樣品的產(chǎn)品/工藝相關(guān)雜質(zhì)殘留水平對病毒清除能力的影響，必要時可將其作為考察因素納入研究，并依據(jù)驗證結(jié)果將上述雜質(zhì)水平納入工藝模塊。后續(xù)計劃應(yīng)用該模塊的產(chǎn)品，其中間體的雜質(zhì)水平應(yīng)在經(jīng)驗證的范圍內(nèi)。對于多因素正交分析法，可以額外考慮對驗證用樣品進行雜質(zhì)加標(biāo)，以拓寬工藝模塊的適用范圍。

5  結(jié)語

由于病毒清除工藝平臺驗證所帶來的時間和成本優(yōu)勢，目前已有多家國內(nèi)外企業(yè)在國內(nèi)新藥臨床試驗申請前（pre-IND）/新藥臨床試驗審批（IND）階段以工藝平臺技術(shù)支持?jǐn)M申報產(chǎn)品工藝中相關(guān)步驟病毒清除性能的評估與驗證。本文希望通過對工藝平臺建立與應(yīng)用的詳細(xì)闡述與實例分析，幫助申請人更深入地理解該技術(shù)的研發(fā)策略和監(jiān)管要求，引導(dǎo)申請人對自身工藝進行全面、深入的表征與驗證或?qū)ο闰炛R進行科學(xué)匯總，在保證申報產(chǎn)品病毒安全性的前提下更好地平衡使用工藝平臺進行申報的獲益與風(fēng)險，為藥品臨床試驗和申報上市階段的病毒安全性控制提供更加全面和靈活的驗證策略。

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